（3)ABC法的评价及实验注意事项
ABC法具有：①敏感性强：Hsu等应用ABC法与PAP法相比发现敏感性较PAP法高20～40倍能显示PAP法所不能显示的抗原。这是因为生物素与抗生物素间有较强的结合力，一个抗生物素分子具有可与生物素结合的4个活性部位，其中一部分可与生物素标记的过氧化物酶相结合，另一部分可与生物素标记的免疫球蛋白结合。生物素通过氨基与抗体或过氧化物酶分子相结合，一个过氧化物酶或免疫球蛋白分子可以结合多个生物素分子，从而增加了免疫球蛋白或过氧化物酶结合抗生物素的能力。在ABC反应中，抗生物素作为桥连接于生物素标记的酶和生物素标记的抗体之间，而生物素标记的过氧化物酶分子又可作为桥连接于抗生物素分子之间，于是形成了一个含有3个以上过氧化物酶分子（大于PAP复合物)的网格状复合物，敏感性极大提高。②特异性强，背景染色淡：由于敏感性高，第一抗体和第二抗体都可被稀释至尽可能的高度，减少了非特异性染色。③方法简便，节 约时间：由于ABC法敏感，操作的抗原抗体反应的时间可由PAP法所需的数天缩短为2h左右，各层抗体作用仅需15min。④国内上海生物制品所等单位制备的生物素—抗生物素染色药盒经质量鉴定符合标准，已提供国内市场。⑤由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。
实验注意事项：
①内源性生物素活性及其消除：生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节 中所产生的羧基的中间载体，它存在于某些组织和细胞内，在应用ABC染色时会与抗生物素结合而产生非特异性染色。因此，对抗生物素结合性较高的组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺，在应用ABC方法前应预先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分别作用20min左右，以消除内源性抗生物素结合活性，每次作用后用PBS洗5min，更换3次。Nar－itoku和Taylor（1982)报告神经组织中的乳糖可与抗生物素结合产生假阳性反应，以2—甲基-O-甘露糖预孵育切片可封闭神经组织内乳糖分子上的结合点，从而阻止与抗生物素蛋白的结合。必要时，也可用0.3%H2O2—100%甲醇孵育以消除内源性过氧化 物酶活性。
②生物素制剂之间相互亲合性差异大，因此在应用ABC试剂时，应注意厂家和批号，对购进试剂应进行事先测试，以保证实验结果的稳定性。
③ABC试剂保存温度以4℃为佳，据报告保存可达两年之久，仍能获得满意效果，而在—20℃生物活性在短期内即被破坏。
2．桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术)
该技术方法是用生物素分别标记抗体和酶，然后以抗生物素为桥，把两者连接起来（图6-2)。
图6-2B RAB技术
检查抗原时，先用生物素标记的抗体与细胞（或组织内)的抗原反应，洗去未结合的抗体，加入抗生物素孵育后，洗去未结合的抗生物素，再加入已标记酶的生物素孵育，洗片，以细胞化学方法呈色反应。
3．标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术) 以生物素标记抗体作第一抗体，酶标记抗生物素作为第二抗体（图6-3)。操作步骤如下：
图6-3 LAB技术
（1)切片在含有25～50μg/ml生物素标记抗体（PBS液稀释)中孵育1h，室温。
（2)PBS洗2次，每次5min。
（3)用20～50μg/ml过氧化物酶标记的抗生物素液孵育90min，水洗。
（4)酶呈色反应。
BRAB法和LAB示是Guesdon及其同事们（1979)建立的，由于这二种方法都需以生物素标记第一抗体，应用不如ABC法普遍。但用于免疫细胞中免疫球蛋白的显示具有特异性。二者比较，LAB法手续较简便，但灵敏度较低。
生物素—抗生物素染色法采用免疫细胞化学染色中各种常用固定剂（见附录)，均可获得较满意的结果。但有实验报告推荐“PLP”固定液（即过碘酸—赖氨酸—多聚甲醛固定液)，其配制法亦见附录。PLP固定后，依次经系列蔗糖磷酸缓冲液（10%，15%，20%各5min)，进行冰冻切片，贴于载片上，置室温风干30min或37℃3～4h或过夜。染色前用PBS湿润水化切片，可获得满意染色效果。
