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免疫球蛋白抗体的提取与纯化
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

  精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术,避免蛋白变性。如分离IgG时,多结合使用盐析法与离子交换法,以求纯化。提取IgM的方法也很多,如应用凝胶过滤与制备电泳法,或离子交换与凝胶过滤等。

  一、盐析法

  取x ml血清加x ml生理盐水,于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵,硫酸铵的终饱和度为50%。

  ↓4℃,3h以上,使其充分沉淀  

  离心(3000rpm),20min,充上清,以x ml生理盐水溶解沉淀,再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

  ↓置4℃3h以上,[此时,(NH4)2SO4的饱和度为33%]

  重复上述第二步过程1~2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白,以0.02% mol/L pH7.4PBS溶解至x ml装入透析袋。

  ↓对PBS充分透析、换液3次,至萘氏试剂测透析外液无黄色,即无NH4+为止。

  取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后,以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。

  影响盐析的因素很多,如蛋白质的浓度,盐的浓度,饱和度和pH,温度等都可影响盐析的结果,操作时要充分注意(参阅本章 第二节 )。

  二、冷酒精沉淀法

  分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水,调节 pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下,加预冷的酒精(-20℃)到最终浓度为20%,保持在-5℃。产生的沉淀(A),含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15~20mol/L NaCl溶液(冷)中,加有0.05mol/L醋酸调节 pH到5.1,产生的沉淀(B),包括大部分的IgA和IgM,IgG留在上清液内。调节 上清液的pH到7.4,加冷酒精(-20℃~-30℃)到最终浓度为25%,维持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%~98% IgG。不同动物,IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀(B)可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物:将沉淀(B)悬浮在0℃ 水中,调节 pH到5.1,离心去除不溶的蛋白。调节 上清液离子强度到0.01~0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%,保持在 –2℃或-3℃低温,所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。医学在线www.med126.com

表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件

物 种

pH

沉淀条件

IgG产量

酒精浓度(%)

离子强度

5.1

15

0.01

65

山羊

5.2

0

0.01

65

5.2

10

0.01

70

大鼠

5.0

15

0.01

50

豚鼠

5.1

15

0.01

70

  三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白

  原理:DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。PH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析,γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG.

  (一)操作步骤

  1.DEAE-Sephadex A-50预处理  称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5g,悬于500ml蒸馏水内,1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/L NaOH 15ml的比例,将A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液中,搅匀,静置30min,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至 pH呈中性;再以0.5mol/L HCl同上操作过程处理,最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次。处理完后,将A-50浸泡于0.1mol/L pH7.4PB中过夜 。

  2.装柱

  (1)将层析柱垂直固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

  (2)将0.1mol/L ,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2~3cm高时,开启出水口螺旋夹,控制流速1ml/min,同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。

  (3)关闭出水口,待A-50凝胶完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

  3.平衡

  启开出水口螺旋夹,控制流速12~14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度,两者达到一致时关闭出水口,停止平衡。

  4.加样及洗脱   启开上口橡皮塞入下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积2%,蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内, 至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗柱壁2~3次 ;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12~14滴/min。

  5.收集

  开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3~5ml 。共收集10~15管。

  6.测蛋白

  以751型紫外分光光度计分别测定每管OD 280nm, 与OD 260nm,按公式计算各管蛋白含量 。并以OD 280nm为纵座标,以试管编号为横座标,绘制洗脱曲线。

  7.合并、浓缩

  将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以PEG(MW6000)浓缩至所需体积,加入0.02% NaN3防腐,于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。

  8.A-50凝胶的再生

  在柱上先以2mol/L NaCl洗脱蛋白至流出液的OD 280nm<0.02,再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存;近期不用时,以无水酒精洗2次, 再置50℃温箱烘干,装瓶内保存。

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