2 器材
2.1 仪器
分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪)、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2µL 、20µL、200µL、1000µL)。
2.2 耗材
眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、0.2 mL薄壁PCR管、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、吸头(10µL、200µL、1000µL)、灭菌双蒸水。
2.3 引物设计
根据GenBank上已发表的炭疽杆菌POX1质粒序列，设计并合成了以下两条引物：
ATXU：5’-AGAATGTATCACCAGAGGC-3’ ATXD：5’-GTTGTAGATTGGAGC
CGTC-3’，此对引物扩增片段为394bp。
2.4 样品的采集与处理
2.4.1 样品的采集
病死或扑杀的动物取肝脏或脾；待检的活动物，用注射器取血5～10mL，2～8℃保存，送实验室检测。
2.4.2 样品的处理
每份样品分别处理。
2.4.2.1 组织样品处理
称取待检病料0.2g，置研磨器中剪碎并研磨，加入2mL消化液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清100µL加入1.5 mL灭菌离心管中，再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中4～16h。
2.4.2.2 待检菌的处理
取培养获得的菌落，重悬于生理盐水中。取其悬液100µL加入1.5mL灭菌离心管中，再加入500µL 消化液和10µL 蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.3 全血样品处理
待血凝后取上清放于离心管中，4℃ 8000 g离心5 分钟，取上清100µL，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.4 阳性对照处理
取培养的炭疽杆菌，重悬于生理盐水中。取其悬液100µL，置1.5 mL灭菌离心管中，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.5 阴性对照处理
取灭菌双蒸水100µL，置1.5 mL灭菌离心管中www.med126.com，加入500µL 消化液10µl蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.5 DNA模板的提取
2.5.1 取出已处理的样品及阴、阳对照，加入600µL酚/氯仿/异戊醇混合液，用力颠倒10次混匀，12000g离心10分钟。
2.5.2 取上清置1.5mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置液氮中3分钟。取出样品管，室温融化，15000rpm离心15分钟。
2.5.3 弃上清，沿管壁缓缓滴入1ml 70%乙醇，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1分钟，真空抽干15分钟(以无乙醇味为准)。
2.5.4 取出样品管，用50µL灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。
2.6 PCR扩增
总体积20µl，取灭菌双蒸水8µl,2.5mmol/L dNTP、8pmol/µL扩增引物、15mmol/L氯化镁、10×PCR缓冲液、0.5单位TaqDNA聚合酶各2µL，2µL模板DNA。混匀，作好标记，加入矿物油20µL覆盖(有热盖的自动DNA热循环仪不用加矿物油)。扩增条件为94℃ 3分钟后，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s循环35次，72℃延伸 5分钟。
2.7 电泳
将PCR扩增产物15µL混合3µL上样缓冲液，点样于1.5%琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于1×TAE缓冲液中电泳，紫外凝胶成像仪下观察结果。
2.8 结果判定
在阳性对照出现394bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时，试验结果成立。被检样品出现394bp扩增带为炭疽杆菌阳性，否则为阴性。
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