（3)免疫染色
①切片（厚50～70nm)贴在金网或覆有碳膜的镍网上。所有下列步骤在室温、湿盒内进行。所有溶液需经微孔滤纸（0.25～0.45μm)滤过。
②正常羊血清30min。
③第一抗血清（PBS稀释)，37℃2h。
④可用烧杯法（或塑料壶喷洗法)，以镊夹镍网在第一烧杯中洗荡30min，然后在第二烧杯中洗荡1h 。
⑤正常羊血清30min。
⑥第二抗血清（胶金标记抗体)以正常羊血清稀释为1：1，以镍网置于血清滴上孵育1h。
⑦冲洗如④。
⑧覆于2%OSO4水溶液上，30min。
⑨冲洗如④。
⑩干燥后在电镜下观察。
（4)Lowicryl K4M快速包埋染色法（Altman等1984)
①包埋剂的配制：单 体13g
交联剂2g
引发剂75mg
②生物样品处理：除了聚合这一步骤外，下列所有步骤都在20℃进行。
1)组织用3%戊二醛—3%多聚甲醛磷酸缓冲液，pH7.4,在20℃固定1～2h。用磷酸缓冲液清洗后进行脱水。
2)脱水：在50%、75%和90%的双甲基甲酰胺（Dimethylformamde,DMF)内系列脱水，每步10min。
3)浸透：Lowicryl K4M:DMF=1:2 10min
Lowicryl K4M:DMF=1:1 15min
100% Lowicryl K4M 20min
100% Lowicryl K4M 25min
4)包埋与聚合：组织移入装满K4M的胶囊中，以紫外线灯照射聚合（紫外线灯条件同上)，灯和组织距离10cm,4℃照射45min，组织块在室温进行超薄切片（切片时水槽内水面应略低以防浸湿组织块的切面)。
5)以覆有碳膜的镍网捞取切片。
6)免疫染色。
整个包埋时间仅需4～5h。
Lowicryls 应保存在暗处，-4℃，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部，氧化重金属如KmnO4能与包埋剂作用而影响染色效果，以不用为佳。
2．LR White 和Lr gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂，具有极低的粘度（8cps)和较强的嗜水性，因此有较强的穿透性，有利于抗体（或抗原)和免疫化学物质穿过LR树脂，达到组织结合部位。在免疫细胞化学的光镜（半薄切片)和电镜水平应用都具有良好效果。标本脱水至70%乙醇即可，能较好地保持抗原性。Lr white和Lr gold在国外提供厂家有 Poly－sciences INC等，Lr gold是一种光引发低发低温聚合的包埋剂，对于免疫细胞化学特别适用，能最大限度地保持组织的抗原与抗体活性，其最佳光聚合温度在-25℃，在聚合后呈现金黄色，因而得名。Lr white可在热和冷两种情况下聚合，热聚合在60℃，24h，冷聚合在-25℃，需加加速剂（accelerator)调整配制比例。生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。
3．GMA 是乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycol Methacrylate 即2—hydroxyethyl methacrylate, HEMA)的缩写。远在60年代，电镜工作者就试图将其作为生物包埋剂应用于光镜和电镜。GMA作为电镜包埋剂的优点是电子密度大，影像反差好。但存在三个主要缺点：一是包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。二是聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。三是缺乏稳定性，不能承受电子束的轰击，包埋剂遇热升华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。聚合后的环氧树脂有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不够满意始终是个有待解决的问题。而GMA包埋切片的染色效果明显优于环氧树脂。于是电镜工作者如Leduc和Bernhard（1986)尝试以增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸酯和少量水外，并加入适量的增塑剂如聚乙二醇400（PEG400)以改变其硬度，加入适量的闻联剂乙烯二甲基丙烯酸酯（ethylene dimethacrylate)以增强其抗电子束轰击的稳定性。为避免聚合时过快，产生高温，损伤组织结构，选用低温型引发剂—过氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide)，温度范围-10℃～-30℃。经过不断的配制改进，现GMA已广泛应用于半薄切片（1～3μm)的光镜观察，特别是组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。现将GMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免疫细胞化学染色方法简介如下：
（1)GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂，用前须以每25ml单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡5min，过滤以除去氢酯，以免影响聚合。
（2)包埋剂的配制：
a. 100% GMA 66.5ml
N—甲基丙烯酸丁酯 28.5ml
5%乙烯二甲丙烯酸酯 5.0ml
1.5 %过氧体苯甲酰 1.0g
1.0%PEG 400 1.0ml
b.A液：
GMA单体液 90ml
PEG 400 5～9.4ml
过氧化苯甲酰 0.2～0.69g
搅拌溶解后置棕色瓶内； 4℃保存。
B液：
PEG 400 20ml
二甲基苯胺 1ml
应用时A：B按10：1比例充分混合（张承志等1986)。
（3)生物样品处理：组织固定可用PLP液或1%戊二醛溶液（磷酸缓冲液配制，pH7.4)。经系列酒精脱水至新鲜的GMA单体溶液中浸24h。以上步骤可在室温或4℃进行。
（4)包埋聚合：组织移入盛潢包埋液的胶囊内，先放在真空泵内以去除包埋液中的气泡，然后在4℃，以紫外线灯（波长360nm)在距胶囊底部10～20cm处进行照射12～16h，以手指捏胶囊试其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢入热水中以去除胶囊外壳。
（5)切片贴在镍网上，按PAg技术进行包埋染色，其区别于EPON包埋剂者，在于GMA包埋切片染色所需时间较短，在第一抗血清中，GMA室温只需孵育1h，而EPON包埋切片需16～20h；在第二抗血清，即Pag 复合物中室温30min，而EPON包埋切片需1h。铀、铅双染后，电镜观察。
低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的多种抗原。
四、对照试验
为确定方法的特异性，免疫电镜技术也需进行对照试验（同第一章 )。
总之，不论哪一种免疫电镜技术都面临微细结构的保存和组织中抗原活性的保存这一对矛盾，如戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响，而H2O2能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部位产生孔洞。在生物样品处理过程中，应同时注意到这两个方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作应注意彻底，否则非特异性产物和其他污染物会影响特异性反应产物的显示和观察。根据作者经验，以塑料水壶加锥形喷水头喷洗，与镍网面成平行方向，即顺网面喷洗，较之目前通用的杯水洗涤法易于达到清洁目的。冲洗的残留水滴以滤纸吸干时，应注意不要触及载网本身。可将滤纸剪成三角形，以尖端接触水滴，即可达到吸干水份的目的，整个过程中，必须应用双蒸水，容器应专用。
