(三)四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC)
它是一种紫红色粉末,较稳定。其最大吸收光谱为550nm,最大发射光谱620nm,呈橙红色荧光,与FITC的黄绿色荧光对比清晰(图3-9),与蛋白质结合方式同TITC。它可用于双标记示踪研究。化学结构式如下(图3-10)。
图3-9 TMRITC在可见光区的吸收
光谱和发射光谱
图3-10 TMRITC结构式
二、荧光素标记抗体的方法
(一)FITC标记抗体的方法
1.Marsshall 氏法
(1)材料:抗体球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶(25~50ml)、冰及冰槽(或1000ml烧杯)、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯(500ml)、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。
(2)方法及步骤:
①抗体的准备:取适量已知球蛋白浓度之溶液,置入三角烧瓶中,加入生理盐水及碳酸盐缓冲液,使最后蛋白浓度为20mg/ml,缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将三角烧瓶置冰槽中,电磁搅拌(速度适当以不起泡沫为宜)5~10min。
②荧光素的准备:根据欲标记的蛋白质总量,按每毫克蛋白加0.01mg 荧光素,用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
③结合(或称标记):边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中,避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上(大约5~10min内加完),加毕后,继续搅拌12~18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右,故须及时添冰去水;亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。
④透析:结合完毕后,将球蛋白的溶液离心(2500r/min)20min,除去其中少量之沉淀物,装入透析袋中后再置于烧杯中,用pH8.0缓冲盐水透析(0~4℃)过夜。
⑤过柱:取透析过夜的标记物,过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱,分离游离荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定(图3-11,图-3-12)。
图3-11 Sephadex G-25 对FITC
图3-12 FITC与家兔IgG球蛋白在25℃和2℃时结合的动力学(Kawamura 1964)
洗脱液:0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2);过滤量:12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析);收集量:20ml(稀释1.7倍)。
分别以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸盐缓冲液(分别为pH9.5和pH9.0),于2℃下搅拌将其各加入100mg家兔IgG生理盐水溶液中,搅匀后立即将每份分为两半。一半保留于2℃下,另一半置25℃下。间隔一定时间后各取出0.5ml通过sephadex G-25去游离FITC,由上计算出5mg家兔IgG结合的FITC量。