（二)应用生物素标记DNA探针-PA-gold电镜杂交技术（Binder et al,1986)
1．固定 现认为应用4%多聚甲醛加0.1%戊二醛在磷酸缓冲液中（pH7.4)，为较理想的固定剂，也有主张单纯用4%多聚甲醛的，因经实验证明如应用高浓度4%的戊二醛比用多聚甲醛样品其杂交率减低60%。但作者认为应用少量戊二醛可较好的保持细胞的微细结构。也有报告用酒精/醋酸混合液的。多聚甲醛-戊二醛固定时间在15min至1h。然后放入Ringer氏液或PBS，在4℃含7%蔗糖的0.15mol/L磷酸缓冲液中储存过夜。
2．脱水 次日，用0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.4)冲洗30min，然后进行脱水，①65%乙二醇，0℃，60min；②80%乙醇-35℃，120min；③100%K4M：80%乙醇 =1：1，-35℃，120min；④100%K4M：80%乙醇=2：1，-35℃，60min；⑤100%K4M -35℃，过夜。
3．包埋 按照Roth et al（1981)，组织块包埋于盛有K4M的胶囊中，在-35℃紫外线灯（波长360nm)照射聚合24～48h。取出后置室温，用紫外线灯继续照射24h，使变硬易于进行超薄切片。胶囊短期可保存于室温，如需长期保存，宜置于-70℃冰箱中，可保存近1年。
K4M配制（中等硬度)
交联接剂（cross-linker) 2.7mg
单体（monomer) 17.3mg
引发剂（initiator) 0.10mg
可根据硬度需要调整各化合物比例。增加交联剂的量，组织块的硬度增加。
4．切片超薄切片50～60nm，捞于有覆有Formavar和碳膜的镍网上。
5．组织前处理和预杂交用含0.2mol/l Tris缓冲液的0.1mol/L甘氨酸（Ph7.4)冲洗15min，以除去醛类固定剂对杂交和检测的影响，然后2×SSC冲洗15min，再用变性液（70%去离子甲酰胺，2×SSC)在65℃处理样品5～10min，以达到变性的目的。变化后的样品在预杂交液中（50%去离子甲酰胺，0.5mol/l NaCl, 10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,pH7.5)37℃预处理15min。
6．杂交镍网载有切片面覆盖于杂交液滴（约20μl)上，置于湿盒内37℃，1～2h。杂交液成份与光镜原位杂交免疫细胞化学相同（详见第二十章 )，如为DNA探针须在沸水中先煮2～3min，以使之变性，然后迅速移至冰浴。
整个杂交过程须注意防止镍网上的杂交液干掉。
7．杂交后漂洗
含50%甲酰胺的2×SSC液 37℃ 30min
含50%甲酰胺的1×SSC液室温30min
无甲酰胺的1×SSC液室温20min
样品置1×SSc 4℃过夜
0.01mol/L PBS(pH7.2) 室温 10min
4%BSA 封闭 15min
8．羊抗生物素IgG抗体（sigma)1：100（稀释用PBS液：2%NaCl, 0.05% KCl, 0.05% KH2PO4, 0.278% Na2HPO4,另加300mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100)室温反应2h。医学 全在.线提供www.med126.com
9．含0.1% BSA的PBS液洗3×30min。
10．兔抗羊IgG的IgG相连10nm胶体金（Sigma)1：100（稀释用1%BSA缓冲液：20mmol/l Tris –HCl, pH8.2,0.9% NaCl, 0.02mol/L叠氮钠，0.5%Triton X-100),室温反应1h。
11．1%BSA缓冲液3×30min，PBS（pH7.2)15min，蒸馏水洗5min，空气干燥。
12．醋酸双氧铀染色20min，柠檬酸铅染色15min，空气干燥后电镜观察。
应用本法标记有如下优点：（1)可获迅速的信号检测；（2)形态学保存较好；（3)与放射性同位素原位分子电镜杂交技术的信/噪比例相近。是目前公认在电镜水平应用同位素标记原位杂交技术较为理想的方法。胶体金颗粒电子密度高，明显地区别于非特异性染色与污染，能达到较为满意的超微结构定位。本技术的难点在于：①实验周期长；②亲水性低温包埋剂制作切片，由于亲水性强，捞取比较困难，切片易于破裂；③探针的纯度与杂交后彻底的漂洗，这是本实验成功的关系，而彻底的漂洗又易导致镍网切片的破裂，作用推荐应用大量漂洗液或漂洗中设置多个漂洗杯，勤换漂洗液，或用软塑料瓶加笔状喷头，增加水压等方法，但不论漂洗或喷水冲洗都必须注意水流与网面平行而不能垂直，否则更易导致切片的破裂。④杂交时间：Binder等证明杂交1h即可出现特异性，到5h之内不断增加。Lawrence和Singer（1985)实验也表明杂交后3～4h杂交时特异性就可达到最大值，虽然此后杂交仍继续进行，杂交率并不再增加。焦仁杰等（1992)对整装细胞的试验也与上述实验相同，他们发现杂交4h和杂交20h相当，但前者的结构保存要好得多。他们实验表明，切片标本的杂交时间大约需9～10h。因此，选择最短而又最有效的杂交时间对有效地保持形态学结构是十分重要的。Binder认为生物素PA-Gold电镜杂交技术所需理想杂交时间为1～2h。⑤应用含甲酰胺（formamide)的缓冲液漂洗易导致金粒聚集的非特异性背景，因此Binder在实验后建议试用以PBS缓冲液漂洗5×10min代替含甲酰胺的盐液，经证明可避免或减少这种非特异性染色；⑥多数作者发现应用K4M包埋剂在电镜杂交技术是最理想的，其结果可与无包埋剂的培养细胞涂片、染色体铺片等的信/噪比值相等。
虽然生物素-PA-Gold电镜杂交技术在K4M包埋切片获得了较为满意的结果，但Lawarence和singer（1985)在比较了三种检测系统的信/噪（signal/Noise,S/N)得到的结果是32P标记为70、3H标记为20、而生物素标记的S/N值最低，为10。Webster等（1987)同时比较了生物素标记P0-HRP糖蛋白cDNA探针（包埋前染色)和生物素标记P0-糖蛋白cDNA探针-蛋白A-胶体金（包埋后染色)电镜杂交技术，观察15天大鼠三叉神经节 雪旺氏细胞髓鞘的标记，固定剂应用PLA溶液（4%多聚甲，15%（V/V)饱和苦味酸)和0.08%戊二醛（用磷酸缓冲液配)，二者均获显示，但作者仍认为应用PA-Gold电镜杂交技术在K4M包埋切片上进行载网杂交的显示结果以及形态保存更为理想。
