综合性实验二幽门螺杆菌的PCRRFLP分型

一厌氧菌的检验

由于机体的防御机能减弱；皮肤或粘膜受损；长期使用免疫抑制剂和广谱抗生素等原因，易

破坏菌群之间的相互制约关系，即菌群失调，厌氧菌大量繁殖引起内源性或外源性感染。厌

氧菌所致的感染可遍及人体各个部分。据报道，腹腔、肺、脑、牙周等部位的感染率非常高

。随着感染类型的改变，厌氧菌的检出尤为重要。

图10厌氧罐示意图

对厌氧菌的鉴定分类主要依据两个重要特性，一是基因型特性：如DNA的G+Cmol%含量和DNA

同源性。二是表型特性：包括形态(大小、形状、动力和芽胞等)、细胞壁成分、能量代谢类

型及发酵产物。

一厌氧菌的培养方法

现代厌氧培养技术的基本要求，一是保持无氧环境；二是要保持培养基呈还原状态。为了

达到上述目的，措施很多，主要有利用催化剂、还原剂和气体置换三个方面。国内外比较通

用的有厌氧罐法、生物袋法、厌氧箱法和生物耗氧法(如疱肉培养基)。

厌氧罐法厌氧罐(见图10)是由塑料、有机玻璃制成的圆柱形容器

，罐口与盖子通过有旋钮

的金属夹子紧紧封闭。厌氧罐的使用通常采用抽气换气法，需要一台真空泵、两个气体瓶：

一个混合气体瓶(含N280%，CO210%，H210%)和一个高纯氮气瓶，以及钯催化剂和亚甲

蓝指示剂。

混合气体中的H2和CO2是厌氧培养所不可缺少的，H2在催化剂的作用下与罐内残余的O

2化合

成水；CO2则是许多细菌生长所必需的。亚甲蓝是氧化还原指示剂，有氧时呈蓝色，无氧

时

为无色。试验时，将亚甲蓝溶液(氧化型)隔水煮沸使蓝色变为无色(还原型)。然后，立即放

入厌氧罐内，如罐内保持无氧状态，亚甲蓝溶液无色；如罐内有氧气，亚甲蓝溶液变为蓝色

。

厌氧罐的使用操作步骤是将接种标本的平皿(宜正放)或试管(松开塞子)放入厌氧罐内，同时

放入催化剂和指示剂。拧紧盖子，开始抽气，待抽到—600～-740mmHg时，停止抽气，灌入

高纯氮气，使压力表指针退回“0”为止。如此反复抽气灌气2～3次，最后一次灌入混合气

体，封闭气道，将厌氧罐置37℃温箱内孵育。

厌氧箱法厌氧箱是目前开展厌氧菌工作最先进的设备，可以接受

处理大量标本，全部操作

(包括细菌的接种、培养、鉴定)均在完全无氧条件下进行，避免了用其它方法因操作暴露于

空气中太久，致使部分厌氧菌死亡的缺点，这无疑有利于厌氧菌的检出。厌氧操作箱一般都

具备下述部件：操作室、进出口小室、催化剂板盒、孵育箱、厌氧度指示剂、真空度表和

电热器等。

二厌氧菌的分离培养

1、厌氧菌的常规分离程序

2、厌氧菌分离培养要点

(1)正确地采集标本并在无氧环境下立即送实验室。

(2)收到标本后应尽快进行接种培养。

(3)使用的厌氧培养基应新鲜配制。

(4)有合格的厌氧培养条件和可靠的分析鉴定方法。

3、初代培养应注意的问题

(1)厌氧菌的初代培养除某些脆弱类杆菌和产气荚膜杆菌生长较快外，一般生长较慢。故一

般至少需培养48小时后才能取出观察。

(2)对于病情紧急的病例可行双份培养。一份培养18～24小时观察；另一份培养3～5天观察

。

(3)厌氧培养48小时无生长者，应继续培养5天以上，培养2周仍无生长者即可报告阴性。

二幽门螺杆菌的分型

1983年，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,简称HP)由Warren和Mashall等人首次从人胃粘

膜中分离出。十多年的研究表明：HP感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因，并与

胃癌及胃的淋巴瘤有密切的关系。目前，HP已成为微生物学、流行病学和消化内科学研究的

热点之一。

迄今为止，HP感染的容易复发原因、传染源及传播途径尚不清楚。为了阐明这些问题，应建

立一种分辨力高、重复性好和快速的HP分型方法。近年来，分子生物学技术，尤其是PCR

技术，被引入微生物分型研究，细菌分型技术及其应用取得了很大进展。

一HP基因分型方法

基因分型方法主要有：质粒分型法、染色体DNA限制性核酸内切酶分析法、染色体DNA脉冲场

凝胶电泳法、基因探针法、PCR扩增产物酶切分析法、PCR单链构型多态性分析法和核苷酸序

列分析法。

1、染色体DNA限制性核酸内切酶分析法(见微生物快速诊断新技术

一节)

2、基因探针法

HP染色体DNA经核酸内切酶酶切、电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，加入标记

的

细菌16S+23SrRNA基因或其它核苷酸探针，作Southern印迹分析，不同HP菌株的杂交条带的

数目和位置不同，即菌株之间存在限制性片段长度多态性(restriction fragment length p

olymorphisms,RFLP)。根据RFLP谱型，可判断不同菌株的亲缘关系。如果两个HP分离株的RF

LP图谱存在明显差异，就认为属于不同型；如差异较小，可认为属于同一型中的不同亚型。

基因探针分型法杂交条带为2～10条，结果易于观察，分辩力高，重复性好，不需要特殊的

实验仪器。现在倾向于用地高辛标记探针，无放射性危险。探针制备和标记可利用PCR技术

，方法简单、快速、产量高，PCR产物不需提纯，可直接用于Southern杂交，标记好的探针

可在—20℃保存一年以上。但是，基因探针法耗时较长，技术要求高，并需要首先提取和定

量纯化的染色体DNA。

3、PCR扩增产物酶切分析法

利用PCR技术扩增HP的某一特定序列(如尿素酶基因)，PCR产物经限制性内切酶消化，琼脂糖

凝胶电泳分离后，显示出简单直观的RFLP谱型，即不同HP菌株的酶切片段的数目和大小不同

。

PCRRFLP分型法重复性极好、分辨力高，尤其是利用PCR技术，只需少量细菌通过煮沸法裂

解细菌，获得DNA粗提液作为模板；也可直接检测胃粘膜标本中的微量靶DNA。整个实验可在

数小时内完成，便于对大量标本进行分析。扩增的片段越长，分型效率越高，但扩增的片段

超过1Kb，PCR的重复性不很稳定。

二分型方法在HP研究中的应用

1、研究HP感染复发的原因

感染HP的病人经抗生素治愈后很快复发，复发率可高达80%。复发是由治疗前感染的HP菌株

导致，还是由于感染了新的HP菌株?这一问题的阐明，对临床治疗选择用药很重要。单纯从

复发病人中分离出HP菌株是不够的，还必须对治疗前后HP分离株进行基因分型。现有实验证

据表明，复发是由治疗前感染的HP持续感染所致，并且相当一部分病人可能感染了多个亚型

的HP。

2、研究HP感染的传播途径

目前认为人类是HP的主要传染源，人——人传播(口——口传播和粪——口传播)为主要传播

方式。HP感染与某些动物和环境因素也有密切关系。

HP在世界各地普通人群中年龄组的感染率从1～79%不等，多数地区在40%左右。流行病学调

查提示HP感染存在一定的家庭和人群聚集现象，父母为HP感染者的儿童中，其HP感染率远高

于父母未感染者。利用PCR技术，可在唾液、牙斑和粪便中检出HP，并且牙斑和胃粘膜中HP

的分型结果一致，提示HP感染存在口——口和粪——口传播。成功的抗生素治疗后，HP感染

复发原因可能之一是，抗生素杀灭了胃内的HP，但口腔牙斑中的HP未被杀死，可再进入胃内

，从而导致复发。

HP有可能对人和某些种属动物具有感染性，人可能通过与动物的接触或通过食用肉类食物而

感染HP。如从猫胃内分离出猫胃螺杆菌，经形态染色、培养及生化特征、脂肪酸分析、16Sr

RNA基因序列分析，证实与人类HP十分相近，猫胃的病变与人的病变类似，表明HP存在动物

源性传染源，可通过动物与人的密切接触而感染人。

三幽门螺杆菌的分离与鉴定

Isolation and Identification of H.pylori

【实验目的】

1掌握微需氧培养技术。

2了解幽门螺杆菌分离培养与鉴定的常规方法。

【实验原理】

幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性微需氧菌，必须在微需氧条件下才能生长，可以采用厌氧罐培

养法。先抽去罐内空气，然后充入N2、CO2和H2混合气体，使之达到微需氧状态。

幽门螺杆菌能产生大量的尿素酶，分解尿素形成大量的氨，使培养基酸碱度上升而变成碱性

，加入酚红指示剂呈红色，是为阳性反应。因此，可利用快速尿素酶试验对幽门螺杆菌加以

鉴定。

【实验内容和方法】

一培养基的制备

【材料】

空肠弯曲菌选择性培养基羊血混合抗生素

【方法】

1称取适量的空肠弯曲菌选择性培养基，置于三角烧瓶中，加入适量蒸馏水，充分溶解。

2高压蒸汽灭菌(121℃)约15～20分钟。

3待培养基冷却至50～60℃时，加入7～10%脱纤维羊血或兔血(临用前37℃预温)，混匀。

4初代分离需加混合抗生素(两性霉素：2ug/ml，万古霉素：6ug/ml，多粘菌素：2.5IU/ml

)，混匀。

5倾入灭菌的空培养皿制成平板，或倾入试管中制成斜面。由于加有混合

抗生素，故为幽门螺杆菌选择性培养基。

二幽门螺杆菌的分离培养

【材料】

胃粘膜活检标本幽门螺杆菌选择性培养基(平板)接种环混合气体厌氧罐抽气换气

装置超净工作台

【方法】

1将胃粘膜活检标本(最好采用尿素酶强阳性标本)直接涂抹接种于幽门螺杆菌选择性培养

基(平板)上，将平板置于厌氧罐内，并放置两个装有灭菌水的试管，以保持一定的湿度。

2抽气：将厌氧罐的抽气橡皮管插在真空泵的抽气接口上，打开真空泵电源开关，抽至压

力表指针至—500mmHg时，用止血钳夹住与真空泵相连的橡皮管，关闭电源。

3换气：打开混合气体钢瓶气阀，向厌氧罐中充入混合气体(80%氮气，10%氧气和10%二氧

化碳)，使真空表指针返回到零位，用止血钳夹住罐体的排气管以封闭厌氧罐，同时关闭混

合气体钢瓶阀门。

4将厌氧罐置于37℃培养3～7天后观察结果。

三幽门螺杆菌的鉴定

 【材料】

结晶紫染液芦戈氏碘液95%酒精稀释石炭酸复红普通光学显微镜尿素酶微量管A

PI鉴定卡

【方法】

1菌落特征观察：幽门螺杆菌在血平板上的菌落呈圆形，凸起，光滑，透明或半透明，有

光泽，边缘整齐，无色或灰白色，菌落大小为0.5～1mm，可轻度溶血。

2革兰氏染色镜检：挑取可疑的单菌落，接种于斜面培养基上增菌、纯化，37℃微需氧条

件下培养2～3天。取少许菌苔制成涂片，进行革兰氏染色镜检，幽门螺杆菌为革兰氏染色阴

性

，呈弧形、S形、海鸥展翅形或稍弯杆状，但在4天以上的培养物中大多数细菌逐渐变短，呈

逗点形且着色不均，最后变成球形。

3尿素酶试验：挑取少许菌苔，接种于尿素酶分解微量管中，30秒至数分钟

内指示剂变为红色，即尿素酶试验强阳性。以变形杆菌和大肠杆菌作为对照。

4API鉴定：方法详见综合性实验一·十·API鉴定系统及其在微生物检验中的应用。

四幽门螺杆菌染色体DNA的提取

Isolation of Chromosomal DNA of H.pylori

【实验目的】

掌握染色体DNA提取的原理和常规方法。

【实验原理】

提取DNA前需将细菌细胞壁断裂(可用溶菌酶消化)，再加入SDS和蛋白酶K消化，一方面有效

地破裂细胞，使核酸从蛋白质里释放出来，另一方面抑制核酸酶的作用，以避免DNA降解。

除去蛋白质最常使用的方法是用苯酚—氯仿—异戊醇混合液抽提。离心后，含蛋白质和

脂质的酚层为下层，而上层水相中含有核酸，变性的蛋白质在中间形成不溶层。提取后，必

须再用氯仿—异戊醇

混合液提取。氯仿的作用是使蛋白质表面变性，同时除去残留的苯酚。异戊醇的作用则是减

少泡沫，有助于分离。最后，在高盐条件下用冷乙醇沉淀

DNA，同时除去残存的氯仿。沉淀的DNA用离心法收集。沉淀DNA用70%乙醇洗涤以除去残存的

盐离子。在提取和转移DNA上清液时应小心，以防机械剪切力使DNA断裂。

【实验内容和方法】

一幽门螺杆菌染色体DNA的提取

【材料】

溶菌酶蛋白酶K苯酚氯仿异戊醇无水乙醇3MNaAc70%乙醇

【方法】

1将幽门螺杆菌新鲜菌苔用布氏肉汤洗下，离心6000转/分，5min。

2沉淀用缓冲液(50mMTrisHCl(pH8.0),20mM EDTA)1.0ml于振荡器上混匀，离心6000转/

分5min，洗两次。

3沉淀混悬于缓冲液(50mM TrisHCl(pH8.0),2mM EDTA)0.5ml，加溶菌酶终浓度为3mg/ml

，37℃作用30min。

4加SDS终浓度0.5%，作用1小时。

5加蛋白酶K终浓度200ug/ml，作用2小时。

6加等体积酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)，抽提两次。

7加等体积氯仿：异戊醇(24∶1)，抽提1次。

8加醋酸纳至终浓度为0.3M，2～2.5倍无水乙醇，—20℃放置3小时。

9离心13000转/分，15min。

10加入70%冷乙醇(保存于4℃)洗DNA沉淀两次，离心12000转/分，5min。

11真空干燥DNA 5min。

12每管DNA用50ul灭菌三蒸水或缓冲液(10mM TrisHCl(pH8.0),1mM EDTA)溶解。短期保

存(数周)于4℃，长期保存(数月)于—70℃.

二DNA定量

取DNA液2ul加18ul灭菌三蒸水，以灭菌三蒸水为空白对照，于紫外分光光度计上测其260nm

和280nm的吸光值，并计算260nm/280nm比值。

五幽门螺杆菌尿素酶C基因的PCR扩增

PCR Amplifcation of H.pylori Urese C Gene

【实验目的】

1熟悉PCR扩增原理及影响因素。

2掌握PCR扩增技术。

【实验原理】

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种选择性体外基因扩增的方法(祥见综

合实验一、十)。PCR扩

增DNA片段的特异性是由两个人工合成的寡核苷酸引物的顺序决定的。PCR是一反复进行的热

变性——复性——延伸的循环过程，即：

①变性：应用高温(一般为94℃)使靶DNA解链；

②复性：温度降低时，靶DNA与两个寡核苷酸引物杂交；

③延伸：在Taq DNA聚合酶(一种耐高温的酶)和4种三磷酸脱氧核糖核苷(dATP、dTTP、dCTP

、dGT

P或dNTP)存在和适宜温度(一般为72℃)下，以靶DNA为模板，引物沿着靶DNA链3′到5′方向

延伸，自动合成新的DNA链，使DNA重新变成双链。

这三个步骤反复地进行30次左右，即可在几小时内将靶DNA扩增上百万倍，经琼脂糖凝胶电

泳溴化乙锭染色后，在紫外灯下肉眼可见DNA条带。

【实验内容和方法】

一引物设计

引物15′TTTGGGACTGATGGCGTGAGGGGTAA3′

引物25′GGACATTCAAATTCACCAGGTTTTGAGG3′

引物互补于HP尿素酶C基因，扩增片段为1132bp。

二PCR扩增尿素酶C基因

【材料】

Taq DNA酶10×PCR缓冲液4种dNTPMgCl2溶液DNA扩增仪微量取样器吸头

Eppendorf管模板DNA

【方法】

1加样：取灭过菌的0.5mlEppendorf管，用微量取样器依次加入模板DNA10～100ng，四种

脱氧核苷

酸(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)分别为200uM，引物各为0.4uM，10×缓冲液10ul，MgCl2溶

液1

0ul(最终浓度为1.5mM)，最后加入灭菌三蒸水使总体积为100ul，混匀后，加入100ul灭菌液

体石蜡油覆盖。

2PCR扩增：在PCR热循环仪上进行。加Taq DNA聚合酶前，100℃ 5min，1个循环

；加入Taq DNA聚合酶后，94℃(变性)1.5min，55℃(退火)1min，72℃(延伸)2min

，30个循环；最后72℃延伸5min。

【注意事项】

●加Taq DNA聚合酶前，可将Eppendorf管直接在沸水中煮沸5min，离心数秒后加酶，最后再

加入石蜡油。

三PCR扩增产物的检测

【材料】

电泳仪电泳槽琼脂糖溴乙锭微量取样器紫外检测仪

【方法】

1制胶：称取一定量的琼脂糖，加入TBE电泳缓冲液，加热溶化，再加入溴乙锭至最终浓

度为0.5ug/ml，混匀后倾注电泳板中，制成2%琼脂糖凝胶。待凝胶冷却后，取出点样孔梳

，置于电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，恰好没过胶面约1mm深。

2点样：用微量取样器取PCR产物5ul和少量溴酚兰(作为指示剂)加入到琼脂糖凝胶孔中。

同时加入标准分子量DNA溶液作为对照。

3电泳：接通电源，电压为5V/cm。

4结果判断：电泳结束后，小心取出凝胶置于紫外灯下观察。非幽门螺杆菌为阴性反应，

幽门螺杆菌为一条清晰可见的DNA条带。

【问题】

①作PCR扩增时应设立哪些对照?为什么?

②如何检测PCR扩增反应的特异性和敏感性?

六幽门螺杆菌尿素酶C基因的RFLP分析

PCRBase RFLP Analysis of H.pyl执业药师ori Urease C Gene

【实验目的】

1了解PCRRFLP分型方法的原理及结果判断。

【实验原理】

尿素酶C基因长为1132bp，经限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳分离后，显示出简单直观

的RFLP谱型，即不同HP菌株的酶切片段的数目和大小不同，据此可将细菌分为不同型或亚型

。结果显示：尿素酶C基因经HaeⅢ或HindⅢ酶切后，可见2～3条带；经AluⅠ酶切后产生4条

DNA条带。综合分析可分为多种酶切类型。

【实验内容和方法】

一PCR扩增产物酶切分析

1取HP尿素酶C基因的PCR扩增产物各510ul，分别用限制性内切酶HaeⅢ、HindⅢ、AluⅠ

、PvuⅠ1020U，按厂家说明操作，37℃作用4小时。

2幽门螺杆菌尿素酶C基因经核酸内切酶消化后，取消化后产物10ul，加入到2%琼脂糖凝胶

上电泳。点样孔梳可根据样品数目、点样量等作出选择。对于一定量的样品来说，宽而薄的

梳子可产生较细而平直的带，适合于酶切图谱的分析。

3在紫外灯下观察酶切图谱，拍照。

【问题】

PCRRELP分型的原理是什么?有何实际意义?

(龙北国龙敏张文炳罗军)