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第3次课 授课时间：2006年 月 日
课程名称 | 年级 | 05级 | 专业、层次 | 临床医学等各专业本科 | ||||
授课教师 | 邬于川 | 职称 | 副教授 | 课型（大、小) | 小 | 学时 | 3 | |
授课题目 | 凝集反应、酶联免疫吸附实验（ELISA) | |||||||
基本教材及主要参考书 | 医学免疫学实验指导 邬www.med126.com/wsj/于川主编 泸州医学院印刷厂2002 P5~8，P34~35 现代免疫学实验技术 沈关心、周汝麟主编 湖北科学技术出版社 1998 | |||||||
目的与要求： 掌握凝集反应（玻片法、试管法) 掌握ELISA的原理、方法及结果分析 | ||||||||
教学内容与时间安排： 观察上次溶菌酶实验结果---10min 自作早早孕检测（ELISA双抗夹心法)---30min 自作试管凝集实验---40min 自作ABO血型鉴定（玻片凝集)---35min 教学方法：讲授、板书、示教 | ||||||||
教学重点及如何突出重点、难点及如何突破难点： 教学重点 ABO血型鉴定（玻片法)的原理及结果分析 ELISA的原理、方法及结果分析 教学难点 ELISA的原理、方法及结果分析 试管凝集试验的结果分析 提示：ELISA试验广泛应用于科研实验和临床检测，故让学生熟悉原理及其应用较为重要。 | ||||||||
教研室审阅意见： 教研室主任签名： 年 月 日 | ||||||||
基本内容 | 教学手段 | 课堂设计和时间安排 |
教学进程 一 观察溶菌酶实验的结果 1 首先看阴性、阳性对照出现结果，阴性对照孔周或滤纸片周围不会出现溶菌环，而阳性对照孔周或滤纸片周围出现明显的溶菌环， 2 再看待检标本周围溶菌环出现的情况，定量检测时其直径与所加标本中溶菌酶的含量成正比。 二 酶联免疫吸附实验 （Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) ELISA是固相吸附技术和免疫酶标记技术相结合的一种方法，它是目前应用最广泛的检测技术。它利用了免疫反应（即抗原-抗体反应)的高度特异性和酶促反应的高度敏感性（可达ng水平)，进行对抗原或抗体的检测，是一种定性和定量的综合性技术。 抗原或抗体吸附到固相载体表面，仍保持原有免疫活性。而酶标抗体或抗原中，酶活性与免疫活性互不影响，且酶标记物中的酶催化底物显色，显色的深浅与相应抗原或抗体含量成正比，因此可用酶标仪作定量检测。 检测方法有三种： 间接法—常用于抗体检测；双抗体夹心法—常用于抗原检测；竞争抑制法—既可用于抗原检测，也可用于抗体检测 下面以早孕孕妇尿HCG检测为例介绍双抗体夹心法： 【材料】 ⒈ 包被了抗-HCG的酶标反应杯、酶标抗-HCG、洗涤液、底物、显色液（商品化试剂)。 ⒉ 待检尿样。 ⒊ 烧杯、蒸馏水、毛细吸管、吸水纸等。 ⒈ 用毛细吸管向反应杯内加待检尿样1滴，再加酶标抗-HCG1滴，室温反应2min。 ⒉ 杯内先加洗涤液1滴，并用蒸馏水加满反应杯后洗涤，倒掉液体并甩干，继后仅用蒸馏水加满反应杯洗涤5次，用吸水纸拍干杯内液体。 ⒊ 加底物1滴。 ⒋ 加显色剂1滴，室温反应2min。 【结果】 杯内液体无色为阴性、蓝色为阳性。可用酶标仪检测尿中HCG的含量。 【注意事项】 ⒈冰箱中保存的商品化试剂取出恢复至室温后再使用。 ⒉洗涤要彻底，防止出现假阳性。 ⒊各试剂的小盖不要戴错，否则可造成假阳性。 凝集反应 内容： 一、直接凝集反应 （一) 玻片凝集反应—细菌的鉴定、ABO血型鉴定 （二) 试管凝集反应 二、间接凝集反应 （一) 正向间接凝集反应—间接凝集乳胶试验、间接血凝试验 （二) 反向间接凝集反应—反向间接血凝试验、协同凝集试验 （三) 间接凝集抑制试验
三 自作试管凝集实验 【原理】 本试验是用已知的颗粒性抗原来检测未知的抗体及其相对含量，此法属定量试验。方法是用生理盐水将待测血清在试管中进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量的已知抗原悬液，经过一定时间后，观察有无凝集并根据凝集程度判定血清抗体的效价。 【材料】 ⒈伤寒杆菌H菌液。 ⒉伤寒杆菌免疫血清（1∶10稀释)。 ⒊生理盐水、小试管、试管架、1ml和5ml刻度吸管等。 【方法】 ⒈ 取洁净小试管8支列于试管架上，依次编号。 ⒉ 用5ml吸管吸取生理盐水，每管内加入0.5ml。 ⒊ 用1ml吸管吸取待检血清0.5ml加入第1管，吹吸3次，充分混匀后，吸出0.5ml加入第2管，如上依次稀释至第7管，自第7管吸出0.5ml弃去。第8管不加血清作为对照管。见图 4． 用5ml吸管吸取伤寒杆菌菌液，从第8管起向前加，每管加入0.5ml。 5．摇匀后，置室温或37℃24小时后，观察结果。操作程序见表 四 ABO血型鉴定 【材料】 ⑴ 抗A标准血清、抗B标准血清。 ⑵ 载玻片、采血针、碘酒和酒精棉球、牙签、生理盐水、毛细吸管等。 【方法】 ⑴ 取洁净载玻片一张，用记号笔分为两格，于上角分别注明A、B字样。 ⑵ 用毛细吸管取生理盐水于玻片的两格内各加一滴。 ⑶ 用碘酒酒精棉球消毒耳垂或手指尖，采血1~2滴混入玻片上的生理盐水中，迅速用牙签混匀，制成血球悬液。 ⑷ 在两格血球悬液中分别加抗A标准血清和抗B标准血清一滴，分别用牙签两端搅拌混匀，2~5分钟后摇晃玻片，观察结果。 【结果】 混合液由均匀红色混浊状逐渐变为透明，并出现大小不等的红色凝集块者即为红细胞凝集；若混合液仍呈均匀混浊状，无凝集块，则表明红细胞未发生凝集。血型鉴定试验结果及鉴定见表 【注意事项】 ⑴ 试验用载玻片要清洁，并务必注明A和B字样。 ⑵ 待检红细胞悬液不宜过稀或过浓。 ⑶ 要及时观察结果，以防时间过长使标本干涸而影响结果的观察和判定。 做清洁 | 讲授 ―――― 讲授 板书 ―――― 讲授 板书 示教 ―――――― 讲授 板书 示教 ―――――― | 约10min ―――― 约30min ―――― 约40min ―――――― 约35min ―――――― 约5min |
小 结 | 1、ABO血型鉴定的原理 2、血型鉴定的注意事项 3、ELISA的基本步骤 4、试管凝集的基本操作 |
复 习 思 考 题 、 作 业 题 | 思考题 1 常用的ELISA方法有哪些？ELISA双抗夹心法的原理？ 2 什么叫对倍稀释？什么叫凝集效价？ |
下 次 课 预 习 要 点 | 一、试管凝集的结果判定 二、对流免疫电泳 三、动物过敏试验 |
实 施 情 况 及 分 析 |
