实验十二 组织细胞基因组DNA的提取

【实验目的】

生物细胞DNA提取方法较多，本实验熟悉生物细胞DNA提取方法的一种；掌握SDS使蛋白质变性而与DNA分离进行提取DNA的基本原理；熟悉SDS法提取DNA的基本操作过程。

【实验原理】

生物组织中DNA是以DNA-蛋白质复合物的形式存在。在稀NaCl溶液中，DNA-蛋白质溶解度小，RNA-蛋白质溶解度大；在浓NaCl溶液中，DNA-蛋白质溶解度大，RNA-蛋白质溶解度小；据此可分开DNA和RNA。

SDS（十二烷基硫酸钠)，是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质的疏水部位，引起蛋白质构象改变，使蛋白质变性并与DNA分离；SDS也是一种良好的解离剂，可使蛋白质溶解，形成SDS-蛋白质复合物，并使复合物带负电。

氯仿-异丙醇可以将蛋白质除去，离心后形成三层，上层为DNA、异丙醇和水；中层为蛋白质沉淀；下层为氯仿。适量的冷无水乙醇可使DNA沉淀析出。加入EDTA - 2Na（乙二胺四乙酸二钠)可防止DNA酶的降解。

A₂₆₀/A₂₈₀比值可用于检查DNA纯度：A₂₆₀/A₂₈₀ ＝1.8，高纯度DNA；A₂₆₀/A₂₈₀< 1.8，含蛋白质； A₂₆₀/A₂₈₀> 1.8，含RNA。

【实验试剂和器材】

1. 试剂

⑴ 0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA。

⑵ 5 mol/L NaCl。

⑶ 30% SDS。

⑷ 氯仿-异丙醇混合液。

⑸ 0.015mol/L NaCl-0.0015 mol/L柠檬酸钠。

⑹ 冷无水乙醇。

2. 器材

⑴ 低速离心机。

⑵ 镊子。

⑶ 剪刀。

⑷ 三角烧瓶。

【实验步骤】

1. 提取脱氧核糖核蛋白

⑴ 取兔肝3克（2~3只小鼠)，15 mL 0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA洗去血液。

⑵肝匀浆制备：将兔肝置乳钵中剪碎，加15 mL 0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA研磨匀浆，注意不要用力研磨。

⑶ 3000 rpm离心10分钟，弃上清；沉淀加入0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA 15 mL轻轻混悬。

⑷ 3000 rpm离心 10分钟，弃上清；沉淀加入0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA 10 mL 使之溶解，转至50毫升三角烧瓶中。

2. 去除蛋白质

⑴ 加入30% SDS 1 mL 混匀，60℃水浴轻摇15分钟，取出冷至室温。

⑵加入5 mol/L NaCl2.75 mL，轻摇10分钟。

⑶加入氯仿-异丙醇19 mL（沉淀蛋白)，轻摇20分钟，离心 250www.med126.com/sanji/0rpm10分钟。

3. 提取DNA

⑴ 吸上清（水相)转入玻璃离心管（含DNA)，弃沉淀（剩余物)。

⑵加入1.5倍体积冰乙醇（无水乙醇)轻摇至DNA析出。

4. 检测

⑴ 用镊子或玻璃棒取出置试管中，加入0.015 mol/LNaCl-0.0015 mol/L柠檬酸钠1mL。

⑵ 量取10~50 μL(用0.1 mL刻度吸管吸取) 原液，用0.015mol/L NaCl-0.0015 mol/L柠檬酸钠稀释到5 mL（稀释100~500倍)。

⑶ 测A₂₆₀/A₂₈₀（用0.015 mol/L NaCl-0.0015 mol/L柠檬酸钠做空白溶液)。

5. 计算

⑴ DNA浓度：（μg/mL)=A₂₆₀×50×稀释倍数

⑵ DNA纯度：A₂₆₀/A₂₈₀

【实验注意事项】

1．为尽可能避免DNA 大分子的断裂，在实验过程中必须注意：① 研磨时上下用力，应保持低温，研磨时间应短，勿用玻璃匀浆器。② 实验中使用的吸取DNA 水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。③ 抽提时勿剧烈振摇。

2．保医学全.在线持DNA 活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA 变性。

3．加入氯仿—异丙醇后勿剧烈摇动，以免大分子断裂。

4．有机溶剂对人体有害，操作时要注意。

【思考题】

1．如样品中有蛋白质存在，其紫外分析结果有何表现?如何进一步纯化？

2．DNA 的定量可采用那些方法?目前常用的是哪种?如何测定DNA 的含量？

3．从生物细胞中提取DNA 的主要注意点是什么?应如何控制？

4．能引起DNA 变性的因素有哪些？DNA 降解和DNA 变性有何区别？如何鉴别？