实验八  心、肝、肾组织乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离

【实验目的】

强化学生对电泳基本原理的理解与记忆；进一步熟记醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质的基本原理及操作；掌握乳酸脱氢酶（LDH)同工酶的组织特异性。

【实验原理】

同工酶是指催化的化学反应相同，而分子结构、理化性质及免疫学特性都不相同的一组酶。乳酸脱氢酶（LDH)是糖酵解过程中很重要的一种酶，其作用是催化丙酮酸与乳酸的相互转化。LDH实际上是由几种理化性质及免疫学特性不相同而催化功能相同的蛋白质分子组成的一组酶，统称为乳酸脱氢酶同工酶。LDH酶蛋白分子是由四个亚基组成的四聚体，因LDH亚基的种类和数目不同，故有五种同工酶的分子形式，即：LDH₁、LDH₂、LDH₃、LDH₄和LDH₅，它们的组成、结构和等电点均不同，在特定的pH条件下（一般为pH8.6)所带电荷数量不同，在电场中泳动速度不同。当朝正极方向泳动时，最快的是LDH₁，依次为LDH₂、LDH₃、LDH₄，泳动最慢者是LDH₅。

不同组织中LDH同工酶的分布不同，有明显的组织特异性。人的心肌、肾和红细胞中以LDH₁和LDH₂最多，而肝和骨骼肌中则以LDH₅ 和LDH₄最多。脾、胰、甲状腺和淋巴结等组织以LDH₃最多。正常人心肌和肝、肾组织提取液的LDH同工酶谱见图2-3。

图2-3  LDH同工酶谱示意图

分离LDH同工酶常用的支持物有醋酸纤维素薄膜、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖及淀粉凝胶等。本实验用醋酸纤维素薄膜为支持物，分离心肌、肝组织、肾组织提取液的LDH同工酶，其优点是设备简单、操作方便、标本用量少、电泳时间短及区带分离清晰等。

电泳后，将醋酸纤维素薄膜复盖于浸有底物（乳酸钠)和显色剂——吩嗪甲氧硫酸酯(phenazinemethosulfate，PMS)和氯化硝基四氮唑兰（nitrobluetetraxolium，NBT)混合液的www.med126.com/sanji/醋酸纤维素薄膜上，37℃保温，使酶起催化反应，可出现深浅不同的五条色带，称为同工酶谱。其显色机制为：

健康人血清LDH同工酶的分布如下表：

 血清LDH同工酶是各组织释放的LDH的总和，当某一组织受损时，它含有的LDH同工酶就会大量释入血中，血清LDH同工酶谱表现出受损组织的LDH同工酶的特征。例如，血清LDH₁和LDH₂增高常见于心肌损伤；血清LDH₅增高常见于肝或骨骼肌有损伤。因此，血清LDH同工酶谱的改变能反映出疾病的部位和损伤的程度，有助于观察病程的转归和判断治疗效果。

【实验试剂和器材】

1．试剂

⑴ 心肌提取液：取新鲜兔心，除去附着的结缔组织和脂肪，称重，剪成碎片，放入研钵中，加入两倍体积预先冰冷了的去离子水，磨成匀浆后取上清液点样。

⑵ 肝（肾)组织提取液：取新鲜兔肝（肾)，称重，加两倍体积预先冰冷了的去离子水，放在研钵中磨成匀浆后取上清液点样。

⑶ 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5)：称取Na₂HPO₄·7H₂O 22.55 g和KH₂PO₄ 2.16 g，蒸馏水溶解后稀释至1000 mL。

⑷ 1 mol/L乳酸钠：吸取乳酸钠液（比重1.38 ~ 1.42，含量60 ~ 70%)5.3 mL溶于50 mL0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5)中，混匀，冰箱保存。

⑸ 吩嗪甲氧硫酸酯（phenazine methosulfate，PMS)溶液（1mg/mL)。置棕色瓶中，4 ℃保存。对光敏感，呈绿色即不能使用。

⑹ 氯化硝基四氮唑兰（nitrobluetetraxolium，NBT)溶液（3mg/mL)。

⑺ 染色应用液：1 mol/L乳酸钠液0.8mL，3 mg/mL NBT 1.6 mL，1 mg/mL PMS0.6 mL，辅酶Ⅰ20 mg，临用前配制。

⑻ 巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.05)：分别称取巴比妥1.85克，巴比妥钠10.3克，溶于100 mL蒸馏水，加热助溶。待冷后倾入1000 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀。

2．器材

⑴ 电泳槽和电泳仪。

⑵ 刻度吸量管（1mL，2mL)。

⑶ 醋酸纤维素薄膜（6×3 cm)。

⑷ 点医学全.在线www.med126.com样器或血红蛋白吸管。

⑸ 有盖搪瓷盘。

⑹ 载玻片。

⑺ 电热恒温水浴。

【实验步骤】

1．准备  在电泳槽的电极室内加适量pH8.6巴比妥缓冲液并搭好滤纸桥。

2．加样  准备甲、乙两条6×3cm的醋酸纤维素薄膜，将甲条浸于pH8.6巴比妥缓冲液中充分浸透后取出，用滤纸将膜的多余水分吸干。用X光软片为点样器，在盛有组织提取液的表面皿内蘸一下，使软片下端均匀地粘附上组织提取液，然后紧按在无光泽面的距一端1.5cm的醋酸纤维素薄膜处，待样品全部渗入膜内，移开软片。将点有样品的薄膜置于电泳槽滤纸桥上，点样面向下，点样端放阴极。

3．电泳  通电，电压150~170V，电流0.6~1.0mA/cm，电泳45分钟。

4．染色  电泳结束前15分钟配制染色应用液。将乙条薄膜浸入染色应用液中完全浸润后取出，光面朝下，贴在玻璃片上。然后将甲条电泳膜取出，用滤纸迅速吸干两端上的缓冲液，无光泽面朝下贴在乙条薄膜上，将玻片移入有盖搪瓷盘内，盘内置湿纱布一条以保持盘内一定湿度，于37℃保温3~5分钟，观察蓝紫色区带，并比较三者的结果。

【实验注意事项】

1. 所用仪器须绝对清洁，整个实验过程必须控制温度和时间，以求结果准确。

2. 缓冲液pH应准确，基质液要新鲜配制。

3. 染色时应注意薄膜上的染液要适量，过多会导致同工酶区带扩散，过少则会因为膜干燥而无法进行酶促反应。

4. 电泳温度不能过高。若室温超过25℃时则需用冰降温，以免影响酶活力。

【思考题】

1．用什么方法可证明醋酸纤维薄膜有无电渗作用?

2．电场强度愈高蛋白质在醋酸纤维薄膜上的泳动率愈高，是否电场愈高愈好?

3. 乳酸脱氢酶（LDH)的分子组成特点是什么？与电泳速度有关吗？