实验五 血痕检验
一、血痕预试验
【目的要求】
熟悉掌握联苯胺试验的原理和方法；了解其它检测血痕预试验的原理及方法。
【实验内容】
检验血痕应先作预试验，包括联苯胺试验、酚肽试验、愈创木酯试验、孔雀绿试验、邻联甲苯胺试验、氨基比林试验、鲁米诺试验、紫外线浓硫酸试验及纸色谱法等。血痕预试验的基本原理是血痕中的血红蛋白或正铁血红素具有过氧化物酶活性，遇H2O2可使之分解成H2O与新生态氧，后者可使某些化学物质氧化，形成氧化产物而呈颜色反应。某些植物汁中也含有某种具有过氧化物酶活性的物质，可使预试验发生阳性反应。氧化剂也可直接氧化某些化学物质，故预试验阳性只能说明被检斑痕可能是血痕，但不能确证为血痕，阴性则可排除血痕。
（一)仪器设备及试剂
1．仪器设备
剪刀、凹玻片
2．试剂
（1)联苯胺无水乙醇饱和液
取联苯胺1g置于棕色瓶内，加20ml无水乙醇，置于50℃温箱中2h助溶，然后降至室温。此时大部分联苯胺已溶解，上清液即为联苯胺无水乙醇饱和液，置于4℃冰箱种备用。
（2)冰醋酸
（3)3%过氧化氢
（二)检材
血痕、果汁斑、唾液斑、植物汁斑、高锰酸钾、尿液、痰液
（三)联苯胺试验原理
血痕中的血红蛋白或正铁血红素具有过氧化物酶活性，能使H2O2分解成H2O与新生态氧，后者使联苯胺氧化成翠蓝色的联苯胺兰。
（四)实验方法
1．剪取或刮取检材少许，置凹玻片孔内或小滤纸片上。
2．加冰醋酸1滴，然后加联苯胺无水乙醇饱和液1滴。
3．1-2分钟后，若不出现兰色反应，再加3%H2O2 1滴，立即出现翠兰色为阳性反应，否则为阴性反应。
4．血痕与唾液斑、果汁斑、植物汁斑、尿液、痰液、高锰酸钾等的实验结果，并进行讨论。
【www.med126.com/sanji/注意事项】
1．必须严格遵守加试剂的顺序
2．本试验方法灵敏，微量检材即够，严禁在检材上滴加试剂作反应，以免破坏检材。
3．取检材时，应防止相互污染。
【思考题】
1．苯胺试验阳性，是否证明检材含有血？为什么？
2．本试验为什么必须严格遵守加试剂的顺序？
二、血痕确证试验
【目的要求】
熟悉掌握高山氏结晶试验的原理和方法；了解其它检测血痕确证试验的原理及方法。
【实验内容】
确证试验的目的是确证检材是否为血，主要依据是检材中是否含有血红蛋白或其衍生物。
（一) 仪器设备及试剂
1． 仪器设备
载玻片、分离针、小刀、盖片、显微镜。
2．试剂
高山氏试剂：混合10% NaOH 3ml，30%葡萄糖10ml，吡啶3ml，置于棕色滴瓶内。放4℃冰箱12-24小时即可使用，如果试剂放置过久，将会失效。
（二)原理
血痕中的血红蛋白在碱性溶液中分解为正铁血红素和变性珠蛋白，在还原剂葡萄糖的作用下，正铁血红素还原成血红素，与变性珠蛋白或其它含氮化合物如吡啶结合，形成血色原结晶。
（三)实验方法
1. 取检材少许（如系织物，取纤维1－2mm，如系血痂，刮下1－3mm)置于玻片上，用分离针将纤维分离或将血痂压碎。
2．盖上盖玻片，沿盖片边缘滴加试剂1至2滴（不要挤压或移动盖玻片)，镜检，产生橙红色星状，菊花状或针状的结晶，为阳性反应。
【注意事项】
1．本法操作简便。缺点是试剂容易失效，出现假阴性结果。一般检验以前，先用已知血痕试验，出现阳性结果，说明该试剂可以使用，反之不能使用。
2. 无结晶形成，可将玻片置于酒精灯上稍加热，促使结晶形成，冷后镜检，或将玻片置室温中30min，再行检验。
三、血痕的种属鉴定
【目的要求】
熟悉掌握环状沉淀反应的原理和方法；了解其它检测血痕种属试验的原理及方法。
【实验内容】
血痕种属鉴定是血痕检验的关键步骤之一，种属鉴定有许多方法，包括血清学方法、细胞学方法、分子生物学方法及生物化学方法。以血清学的沉淀反应最为简便实用。
（一)仪器设备及试剂
1. 仪器设备
毛细吸管、小试管、沉淀管、小烧杯、试管架、沉淀架、小剪刀、镊子、大头针、显微镜、离心机、水浴锅。
2. 试剂
抗人血清、抗人血红蛋白血清，生理盐水，发烟硝酸，5%冰醋酸，5%黄血盐（亚铁氰化钾)溶液。
（二)实验方法
1. 血痕浸出液的制备
(1) 取血痕检材0.5cm2，剪碎置试管内，加0.5ml生理盐水，浸泡血痕2-12小时。离心，吸取上清即为血痕浸出液。血痕浸出液应澄清、透亮、呈淡草黄色。
(2) 血痕浸出液蛋白含量的测定：
Ⅰ. 观察浸出液的颜色，如呈淡草黄色相当于1/1000。
Ⅱ. 猛烈震荡浸渍液，若液面上产生的泡沫能持续10秒，蛋白浓度约为1/1000。
(3) 黄血盐冰醋酸法稀释血痕浸出液
I. 取试管20支，分两排放置于试管架上；
II. 将上次的血痕浸出液离心沉淀后，在第一排试管中 以二、五稀释法稀释。
III. 将第一排各管中的稀释液，从后向前依次吸出1/2放入相对的第二排管中。
IV. 在第一排各管中，逐管加入5%黄血盐溶液和5%冰醋酸各1滴，观察在哪一管混浊刚刚消失，即该管含蛋白量相当于1/1000，用二五稀释人血清至5000倍，作为对照。
(4) 硝酸毛细管法稀释血痕浸出液
I. 如上所述，用二、五稀释法将检材浸液作适量稀释
II. 用毛细管插入血痕浸出液中，待液面上升到1-1.5cm 时取出，用棉球轻轻擦去管外液体。
III. 在将此毛细管插入到发烟硝酸中，取出后衬一黑纸，观察两液面接触处高级职称考试网，有无白色混浊。
IV. 依次逐管稀释，至二液接触面有很薄的白环，并略带云雾状，该管的含蛋白量约为1/1000。
2. 环状沉淀反应
(1) 取沉淀管1支，加入抗人血红蛋白（或抗人血清)沉淀素血清约0.1ml。
(2) 吸取经测定蛋白含量约1/1000（或低于1/1000)检材浸出液小心地重叠于抗血清上。
(3) 立即观察沉淀管内两液体之间的界面有无白环出现，再经5、10、15、30、60分钟各观察一次，如在60分钟时仍无白环出现即为阴性。
(4) 取无血痕部位的空白检材，已知人血痕、动物（如鸡、猪血痕等，用同样的方法制备浸出液，同法进行沉淀试验，以保证种属试验的准确性。
一个完整的种属试验应当包括必要的对照和当地常见的或与检案有关的动物血痕：血痕浸出液、无血痕空白检材浸出液、已知人血痕浸出液、生理盐水、动物血痕1浸出液、动物血痕2浸出液。
3. 抗人血红蛋白（或抗人血清)琼脂糖免疫扩散试验
（1) 剪取1mm长的学血痕纤维备用。
（2) 把琼脂糖凝胶放于沸水浴中使其溶解。
（3) 用小烧杯一只，盛少许热水（约60℃)把小试管一只放入烧杯中，用两支口径相同的毛细吸管分别按3:1的比例把人血红蛋白沉淀素血清和琼脂糖凝胶加于试管（即3滴血清1滴琼脂糖混匀后，即吸出一滴于载玻片上（成一圆点状)迅速用镊子夹取血痕纤维埋于琼脂糖中央并在纤维面上补加琼脂糖血清少许。
（4) 待琼脂糖凝固后，把玻片放于湿盒中，在15、30、60分钟时把玻片取出，在暗背景斜光照的条件下，观察血痕纤维周围的琼脂糖内是否有圆形、椭圆形、哑铃型或弧形的灰白色的沉淀环出现，若血痕太陈旧或太淡薄，则观察时间可延长至24小时。
（5) 24小时内有晕环出现为阳性，否则为阴性。
每次检验均以空白检材、已知人血痕和动物血痕作为对照。
