本方法采用高效液相色谱法测定三磷酸腺苷二钠中三磷酸腺苷二钠的含量。

本方法适用于三磷酸腺苷二钠。

供试品经流动相稀释，进入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长259nm处检测三磷酸腺苷二钠的峰面积，计算出其含量。

1. 甲醇

2. 0.2mol/L磷酸盐缓冲液

3. 1mol/L氢氧化钠

1. 仪器

1.1 高效液相色谱仪

1.2 色谱柱

十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按三磷酸腺苷二钠峰计算应不低于1500。

1.3 紫外吸收检测器

2. 色谱条件

2.1 流动相：0.2mol/L磷酸盐缓冲液 甲醇=95 5

2.2 检测波长：259nm

2.3 柱温：35℃

1. 0.2mol/L磷酸盐缓冲液

取磷酸氢二钠35.8g、磷酸二氢钾13.6g，加水900mL溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，加入四丁基溴化铵1.61g，加水至1000mL，摇匀。

2. 1mol/L氢氧化钠

取氢氧化钠适量，加水振摇使溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静置数日，澄清后备用。取澄清的氢氧化钠饱和溶液56mL，加新沸过的冷水使成1000mL，摇匀。

3. 对照品溶液的制备

精密称取三磷酸腺苷二钠对照品适量，用流动相溶解并定量稀释制成每1mL约含0.4mg的溶液，即为对照品溶液。

4.供试品溶液的制备

精密量取供试品适量，用流动相稀释制成每1mL中约含三磷酸腺苷二钠4mg的溶液，即为供试品溶液。

注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10mL，注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器于波长259nm处测定，记录色谱图峰面积，出峰次序依次为一磷酸腺苷钠、二磷酸腺苷二钠与三磷酸腺苷二钠。