公开(公告)号
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CN100363485C
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公开(公告)日
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2008.01.23
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申请(专利)号
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CN200410027944.4
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申请日期
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2004.07.07
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专利名称
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制备重组人粒细胞集落刺激因子用工程菌的发酵方法
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主分类号
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C12N1/20(2006.01)I
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分类号
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C12N1/20(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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深圳新鹏生物工程有限公司
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发明(设计)人
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李政海;李 静;李继东
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地址
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518057广东省深圳市南山区高新技术园北区郎山二路
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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深圳市博锐专利事务所
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代理人
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张 明
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国省代码
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广东;44
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主权项
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一种制备重组人粒细胞集落刺激因子用工程菌的发酵方法,所述工程菌为DH5α-PBV220-hGCSF,其发酵过程包括种子液培养和分批补料发酵,其特征在于: 所述种子液培养包括以下子步骤: 1)菌种的筛选:从菌种保存库中取出所述工程菌,划LB平板30℃培养过夜,挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB试管中培养,至OD600值为0.4-0.6,再于42℃培养4小时,离心收集菌体,SDS-PAGE分析,用重组人粒细胞集落刺激因子表达量最高的克隆作为发酵用种子,分装甘油保存,每批发酵取用一支; 2)一级种子液培养:将种子按2%的体积比接种到含2YT种子培养基的50ml三角瓶中,30℃,200r/min摇床培养,至OD600值为0.6-1.0; 3)二级种子液培养:将一级种子液以1%的体积比接种到含200ml 2YT种子培养基的500ml三角瓶中,30℃,250r/min,摇床培养12-16小时,至OD600值为3.5-6.5,镜检无杂菌,菌种形态正常,即为发酵用种子; 所述分批补料发酵包括以下子步骤: A.发酵前的准备:将8L发酵培养基接入到20L的发酵罐中,115℃灭菌30分钟; B、基本发酵:灭菌后,待培养基温度降到30℃时,按接种量10%体积比接入二级种子液,30℃,培养8小时,开始诱导表达; C、诱导发酵:诱导温度为42℃,诱导4小时,结束发酵; 上述分批补料发酵子步骤B和C中,通过补加4mol/L氢氧化钠控制pH为7.0-7.1,通过调节发酵罐的空气流速和转速,控制溶氧值为50%;并且当OD600值为2时,开始补料,补料方式为每小时补加补料I和II各100ml; 所述补料I的配方为:葡萄糖300g,硫酸铵50g,加纯化水定容至1L; 所述补料II的配方为:酵母粉300g,酪蛋白水解物20g,维生素B1 0.1g,加纯化水定容至1L。
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摘要
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一种制备重组人粒细胞集落刺激因子用工程菌的发酵方法,所述工程菌为DH5α-PBV220-hGCSF,其发酵过程包括种子液培养,包括以下子步骤:①.菌种的筛选;②.一级种子液培养;③.二级种子液培养;和分批补料发酵,包括以下子步骤:①.发酵前的准备;②.基本发酵:按接种量10%体积比接入二级种子液,30℃,培养8小时,开始诱导表达;③.诱导发酵:诱导温度为42℃,诱导4小时,结束发酵;上述分批补料发酵子步骤②和③中,控制pH为7.0-7.1,溶氧值为50%;并且当OD600值为2时,开始补料,每小时补加一定量的补料Ⅰ和Ⅱ。本发酵方法,为解决人粒细胞集落刺激因子制备上存在的表达率偏低、菌体产量偏低、活性偏低以及成本偏高等问题提供了可能。
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国际公布
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