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中国幽门螺杆菌研究:抗幽门螺杆菌尿素酶抗体诊断试剂盒的研制与临床应用
来源:本站原创 中医理论数据 字体:

本研究旨在制备纯化的标准化、商品化抗Hp尿素酶抗体试剂盒,供临床ELISA检测用。

1 材料与方法

1.1 试剂盒的制备

Hp尿素酶抗原的分离纯化研制:①经尿素酶试验选择尿素酶活性高的经系统鉴定的Hp菌株接种于含6%脱纤维绵羊血的布氏平皿中,置微氧环境,恒温37℃培养3d收菌,脱洗、稀释后超声适度破裂,高速离心取上清液备用。②选用Sephadex G200柱(2.6×75cm柱型)在凝胶过滤成套设备中从Hp超声破碎物离心上清液中一次提纯Hp尿素酶。③将凝胶过滤后尿素活性峰与相应菌全菌蛋白上柱液及离心沉渣SDS-PAGE分析,观察尿素酶提纯效果。④Western blot(免疫印渍)分析:经SDS-PAGE将各蛋白分离后,经电泳将蛋白转移到硝酸纤维膜上,过渡、洗涤后,放入稀释的抗Hp阳性血清(含抗高分子量菌体相关蛋白)中,震荡、洗涤后,浸泡于稀释后的辣根过氧化酶—葡萄球菌A蛋白液洗涤后将该膜放入新配制的底物显色液中,震荡,显色,清洗,照相。

1.2 试剂盒的临床应用

研究对象:①病人:诊断按胃镜及活检病理确定。同期均检测Hp抗体。第一阶段用全菌抗原(抗Hp抗体)。男741例,女459例,年龄为18岁~77岁(42岁±10岁)。第二阶段用商品化试剂盒Hp尿素酶抗原(抗Hp-u抗体)。男1015例,女660例,年龄为16岁~74岁(45岁±7岁)。两组匹配情况相近。②献血员:以上两阶段均有健康献血员同期行Hp抗体检查,各200例。胃镜检查及活检取材:每例在距幽门5cm周径内的部位钳取粘膜标本分别送检病理组织学检查及Hp培养。组织学检查:胃镜活检标本HE染色组织学检查,Giemsa染色确认Hp存在。病理诊断参照全国胃癌防治研究协作组所订标准。炎症程度按正常、轻度、中度、重度分别判定为0、1、2、3级。细菌培养:送检用的输送培养基为10%小牛血清布氏肉汤培养基。每试管分装3ml置入2块胃镜活检组织块。每例活检钳均经消毒液浸泡15min后和酒精擦试。Hp培养基用布氏琼脂培养基为基础为基础,加入脱纤维羊血及联合抗生素、3d后观察结果,并作生化鉴定。

以上组织学与微生物学检查结果独立评价,不受临床资料暗示影响。血清ELISA法测抗HpIgG和抗HpIgG。流行因素调查:制定统一调查表逐项登记。本组共连续调查了1200例。药物治疗:212例Hp阳性胃炎患者随机分为3组。分别服诺氟沙星和胶体次枸橼酸铋(CBS,De—Nol)及安慰剂1个月。停药1月后复查胃镜及血清抗Hp抗体。

2 结果

2.1 Hp超声破碎后

Hp超声破碎后,高速离心,上清液可经SephadexG200柱将Hp尿素酶有效分离。尿素酶活性与脱洗第一峰完全一致,而第一峰中经SDS—PAGE检测只含有30kD及66kD两条蛋白带。与Hp尿素酶两个亚基的分子量一致,经Western blot分析证明第一峰蛋白仍保持了很高的抗原性。

2.2 用提纯的Hp尿素酶进行血清抗Hp尿素酶抗体测定

用提纯的Hp尿素酶进行血清抗Hp尿素酶抗体测定,经已确定的55份阳性血清标本和50份阴性血清标本对照检测,符合率100%。无假阳性及假阴性。

2.3 对1675例进行抗HpIgG抗体检测

对1675例进行抗HpIgG抗体检测。若以培养及(或)组织染色为标准,则ELISA敏感性为98%,特异性96%,阳性预测值为98%,阴性预测值为96%。抗HpIgG抗体半定量结果,本组检验以“++”为临界值标准,敏感性可达98%,特异性达96%;若以“+”为准,则敏感性虽达99.1%,但特异性仅为84.9%。

2.4 各种商品试剂盒比较见表1。提示本组试剂盒检测Hp感染敏感性和特异性均较高。

2.5 各种胃、十二指肠疾病患者血清抗HpIgG抗体检测情况(见表1)。

2.6 流行因素调查

流行因素调查。 本组资料表明以下因素有意义:①Hp感染率随年龄增长递增,至60岁达高峰。②本组肉联厂工人(30例)与副食售货员(菜、肉组)69例抗Hp抗体阳性率分别为90.0%和86.9%,高于其他工种(P<0.01)。③饮食习惯:喜食凉拌生菜、肉食者Hp感染率高(P<0.05)。④家庭成员中有胃十二指肠疾病者,较无此类病者Hp感染检出率高(根据8个家庭、40名家庭成员统计)。

2.7 ELISA血清Hp抗体检测用于Hp阳性胃炎抗菌物治疗后观察抗体滴度下降(表2)。

表1 各种商品试剂盒比较

名称抗原观察例数敏感性(%)特异性(%)阳性预测值(%)阴性预测值(%)
Pyloriseta全菌6868768562
GAP全菌6498778682
Helico G全菌6682838974
Bio-Rad全菌24293.879.39087
ELA-G全菌19592848890
ELA-A全菌19580898979
陈振侬b尿素酶1499286.595.478.1
抗Hpb全菌120094.284.493.890.5
抗Hpu尿素酶16759896989www.med126.com6

a用乳胶凝集试验,余者ELISA测定。b非商品化试剂盒

3 讨论

www.med126.com/shiti/研究采用ELISA半定量检测血清抗HpIgG,经大宗病例临床检测应用,敏感性、特异性高、批内、批间差异小,稳定性强,重复性好。

表2 三组治疗前后血清抗Hp滴度  (x±s)

治疗前停药后 
1月3月6月 
诺氟沙星700±285176±56b165±45b168±89b 
诺氟沙星 
694±282167±48b162±53b166±49b 
+CBS 
685±286649±282b686±278a676±282a 
安慰剂 

经自身对照:aP>0.05,bP<0.01

临床应用观察到,应用本试剂盒,在慢性胃炎消化性溃疡、非溃疡性消化不良各类疾病中,抗HpIgG检测阳性率均很高。尤其在慢性活动性胃炎、十二指肠溃疡中检出率更高,与文献报道一致。Sobala强调血清学Hp抗体检测可用于筛查消化不良,可减少23.3%病例用胃镜检查确立Hp感染。本研究也与之相符。

应用血清Hp抗体为观察指标,来判断用抗Hp药物治疗根除Hp效果,治疗后抗体滴度下降或消失,与近几年一些报道一致。本文认为,用血清抗HpIgG追访疗效,也可减少患者接受胃镜复查Hp根除与否之痛苦。抗HpIgG检测用于流行病学研究无疑是一重要工具。

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