(一) 重量法
根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量。根据被测组分分离方法的不同,可分为提取法、挥发法、沉淀法。
1.提取法用适宜的溶剂提取出样品中的某种成分,再蒸去溶剂进行测定。例如胰酶中脂肪含量测定是用乙醚提取后挥散乙醚,残渣在105℃干燥2hr称重并计算。
2.挥发法是利用被测组分具有挥发性,或将它转化为挥发性物质来进行含量测定的方法。“炽灼残渣”为直接挥发法的一种特殊方式:“干燥失重”为间接挥发法。
3.沉淀法是利用沉淀反应,将被测组分转化成难溶物,以沉淀形式从溶液中分离出来,然后经过滤、洗涤、烘干或炽灼,最后称重并计算其含量的方法。
根据样品中某些成分与标准溶液能定量地发生酸碱中和、氧化还原或络合反应等进行测定。如胰酶的淀粉酶测定是利用氧化还原反应,以淀粉为底物,经淀粉酶水解后产生还原糖,在碱性溶液中还原糖又将斐林试剂中的CUZ+还原成Cu+,多余的Cu+在酸性溶液中与KI作用析出碘,然后用硫代硫酸纳滴定所析出的碘,来推算糖的含量,进而标定淀粉酶的效价。又如L盐酸精氨酸是用电位滴定法测定含量的。
(三)比色法 医学.全.在.线网站www.med126.com
样品与显色剂可发生颜色反应,依颜色反应的强度测定含量。如蛋白质的含量测定,可利用蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应,而进行定量测定。硫酸软骨素的含量也是用比色法测定的,具体介绍如下。
本品系自猪的喉骨、鼻中骨、气管等软骨组织提取制得的酸性粘多糖。按干燥品计算,含氨基己糖以氨基葡萄糖计算,应不得少于24.0%。
本品采用Elson-Morgan色法测定含量,其基本原理为样品先用盐酸水解生成氨基己糖,然后在碱性条件下与乙酰丙酮反应,生成色原物质,再与对二甲氨基苯甲醛反应产生红色,以盐酸氨基葡萄糖为对照品,用比色法测定。
对照品溶液的制备精密称取经105℃干燥至恒重的盐酸氨基葡萄糖0.1g,置l00ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取10ml,置l00ml量瓶中,加水至刻度,摇匀。每1ml中含盐酸氨基葡萄糖0.1mg。
供试品溶液的制备取本品约0.15g,精密称定,置50ml量瓶中,加6mol/L盐酸液使溶解,并稀释至刻度,摇匀;精密量取5rrll置5Oml量瓶中,密塞,置水浴中水解2h,取出放冷,用氢氧化钠溶液(1→5)中和至中性,加水至刻度,摇匀,用干燥滤纸滤过,弃取初滤液,保留续滤液备用。
测定法精密量取对照品与供试品溶液各1ml,各取2份,分别置4支具塞试管中,各加水至5ml;另取具塞试管一支,加水5ml作为空白,各加乙酰丙酮试液 1ml,摇匀,置水浴中(1ml后密塞),准确加热25min,取出,用冰水迅速冷却后,加无醛乙醇3m1,在6O℃水浴中保温10min后,再加对二甲氨基苯甲醛试液1ml,强力振摇,并继续在60℃水浴中保温1h,立即用冷水冷却至室温,照分光光度法,在525nm的波长处分别测定对照品溶液与供试品溶液的吸收度,以两份的平均值,按下式计算:
(计算公式)
式中互为供试品溶液吸收度的平均值,s为对照品溶液吸收度的平均值,Ws为对照品溶液每lml中含盐酸氨基葡萄糖的量(mg),W为供试品重量(mg), 0.8309为氨基葡萄糖与盐酸氨基葡萄糖分子量的比值。本法专属性强,操作简便、结果稳定。值得注意的是实验中所用乙醇必须是无醛乙醇。否则,将影响测定结果的准确性。
(四)紫外分光光度法
样品或转化后的产物在某一波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,其浓度与吸收度成正比,则可进行定量测定。如蛋白质在280nm左右有最大吸收,胰蛋白酶与底物N-乙酰-L酪氨酸乙酯作用后的产物在237nm处有最大吸收,根据其吸收度可进行定量。