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放射性同位素标记核酸探针
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

  最常用的同位素是α-32PdNTP,3HdNTP,及35SdNTP,多用缺品平移法、末端标记法,随机引物延伸法和反转录标记法。在以mRNA制备cDNA时,同时掺入标记的脱氧核苷酸,制出cD-NA标记探针。

  一、缺口平移法

  在适当的浓度的DNase I作用下在一双链DNA上制造一些缺口,再利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的5’—3’外切酶活性依次切除缺口下游的核酸序列,同时将四种脱氧三磷酸核苷(其中一种用放射性标记)利用该酶5’—3’聚合活性补人缺口,使缺口逐个平称并在平移过程中形成标记的新生核酸链。此法也适用于探针的非放射性标记。如32P标记DNA探针(缺口平移法):反应体积为25μl,内含0.3μgDNA片段,4μl 0.2μmol/L dNTP, 1.1×106Bq [α-32P]dATP,1μl2万倍稀释的DNA酶和2μl DNA聚合酶I,6μl缓冲液[为50mmol/l Tris·HCl(PH7.2)、10mmol/l MgSO4、1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)和50μg/ml BSA],反应在14进行3h。标记DNA经Sephadex (G-50)柱层析回收。

  二、末端标记法

  在大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶(T4PNK)的催化下,将γ-32P-ATP上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核苷酸5’端必须带羟基。反应式为:医学.全在线www.med126.com

  此法适用于标记合成的寡核苷酸探针。如将底物改为Bio –11 –dUTP,也可以在3’端标记上一个生物素。

  寡核苷酸35S的3’—末端标记法:将下列液体依次加入Eppendorf管中。

寡核苷酸(1 pmol)1μl

10×Tailing buffer 2μl

  [α-35S]2μl

  双蒸馏水14μl

  末端脱氧核苷酸酶1μl(10Unit)

  混合后,置于37水浴中1.5h。取出反应管放入冰水中5min。加入下列液体:

  TRNA(25mg/ml)3μl

  1×TE(pH8.0)180μl

  酚100μl

  CTAa 100μl

  充分混合2min。离心15000r/min 5min。将上清液(约200μl)移入新的Eppendorf 管中,然后加入下列液体:

4mol/L醋酸胺100μl

100%酒精800μl

  混匀,置冰浴中,15min。再15000r/min离心10min,在管底可见一白色沉淀块(含tRNA及寡核苷酸)。吸去管中液体,然后加入1000μl80%酒精,混合1~2min同上离心,吸除酒精(勿破坏沉淀块),将管置于40℃温箱中5min。加入适量的1×TE(pH8.0)及0.5mol/l DTT溶解沉淀。标记探针的最终浓度是0.5ng/μl,DTT的最终浓度为20mmol/μl。取出1μl标记探针测定比放射性,应在1.0×10dpm/μg以上。保存在-80℃中1~2个月。再次使用时应考虑到放射性同位素的衰减量。

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