实验二十四  细菌DNA限制性核酸内切酶分析

【原理】

限制性核酸内切酶能识别和切割双链DNA的特异部位，产生系列DNA片段，这些片段经琼脂糖凝胶电泳后可显示为不同的带谱，这些带谱就构成了各不同双链DNA的特征性“指纹(fingerprint)”。

【材料】

1．限制性核酸内切酶  目前常用的有HindⅢ、BamH I、EcoRI、Past I、XhoI、PvuⅡ等，各种酶通常各有其最佳的工作条件，在商品说明书上均有详细介绍，包括酶的识别序列、最适反应条件、温度及贮存条件等参数，故使用前应仔细阅读说明书。

2．细菌DNA  按常规方法提取、纯化细菌DNA、琼脂糖、TAE或TBE电泳缓冲液。

3．电泳仪、水平电泳槽、252nm紫外灯。

【方法】

用电泳缓冲液将琼脂糖配制成所需浓度，加于水平玻璃板医学全.在线上制成凝胶，待凝固后在加样孔中加入经内切酶切割消化的DNA样品，电泳时电压2～5v/cm，电泳时间8～12min，电泳完毕后将凝胶浸于含0.5μg/ml溴乙锭的电泳缓冲液中染色30min，紫外灯照射下拍照。

【意义】

各种属细菌的酶切图谱有明显不同，同种不同型、甚至同型不同株的细菌也可能在图谱上显示其差异。限制性内切酶分析法重复性、稳定性、敏感性均较好，且操作简便，可快速得到结果，因此在细菌的鉴定、分型及进行分子流行病学研究等方面应用较广。