实验十四  白喉棒状杆菌

白喉棒状杆菌(白喉杆菌，C. diphtheriae)为革兰阳性杆菌，菌体细长，粗细不均，一端或两端膨大呈棒状，菌体内有异染颗粒，排列不规则，常呈V、L形或堆积如栅栏状。白喉杆菌无芽胞、荚膜与鞭毛，异染颗粒和特殊的排列是其主要形态特征。

白喉杆菌需氧或兼性厌氧，在普通培养基中生长缓慢，在吕氏凝固血清培养基上生长迅速且菌体的异染颗粒明显；亚碲酸钾血平板是白喉杆菌的选择鉴定培养基，常用于白喉杆菌的生物分型。

白喉杆菌能产生白喉外毒素，致白喉。

（一)形态与培养特性

【材料与方法】

1．油镜下观察白喉杆菌革兰染色示教片及奈瑟(Neisser)染色示教片。

2．观察白喉杆菌在吕氏凝固www.med126.com血清斜面、血平板及亚碲酸钾血平板上的培养特性。

【结果】

1．革兰染色片中的白喉杆菌为紫色细长杆菌，着色深浅不均，排列不规则；奈瑟染色片中的白喉杆菌为淡黄色细长杆菌，菌体内有深蓝紫色异染颗粒，排列不规则。

2．白喉杆菌在吕氏凝固血清斜面上形成灰白色的菌苔；血平板上的白喉杆菌菌落呈圆形，直径约1mm，灰白色，不透明，光滑，边缘整齐，轻型菌株的菌落周围有狭窄的溶血环；亚碲酸钾血平板上的白喉杆菌的不同型别的菌落可呈灰黑色、灰色或黑色，其他特性与血平板上的菌落相同。

（二)阿伯特(A1bert)染色法

阿伯特染色法是白喉杆菌常用的染色法之一，常用于白喉杆菌的分离鉴定。

【材料】

1．白喉杆菌吕氏凝固血清斜面12～18培养物。

2．阿伯特染液等。

【方法】

1．自斜面取白喉杆菌作涂片、干燥及固定。

2．染色：滴加阿伯特染液甲液，染色5min后水洗，再用乙液染色1min，水洗，干后镜检。

【结果】

镜检：白喉杆菌细长，排列不规则，菌体呈蓝绿色，异染颗粒为蓝黑色。

（三)毒力试验(Elek平板法)

白喉杆菌的有毒菌株可产生白喉外毒素，白喉抗毒素可与其特异性结合，中和白喉外毒素的毒性，可用细菌培养法和动物试验予以证实。

【原理】

Elek平板毒力试验是一种体外的毒力测定方法。通过观察白喉抗毒素与白喉外毒素的双向琼脂扩散现象，判断所培养的白喉杆菌的产毒性。

【材料】

1．产毒素的白喉杆菌、类白喉杆菌及待测的白喉杆菌吕氏血清斜面24h培养物。

2．Elek琼脂蛋白胨培养基。

3．白喉抗毒素(1000u/m1)、马或兔血清(无菌)、无菌滤纸条(6.0×1.5cm)、无菌5ml刻度吸管、无菌平皿及镊子等。

【方法】

1．将Elek琼脂蛋白胨培养基10ml加热融化，待冷至50～55℃时，加入无菌的马或兔血清2ml，立刻混匀，并倾注平板。

2．趁琼脂未凝固前，用无菌镊子将浸有白喉抗毒素(1000u/m1)的滤纸条(尽量使滤纸条上的抗毒素流尽)贴于平板中央，待琼脂凝固后将平板置37℃温箱内1～2h(平板面朝下)，使培养基略干燥。

3．如图14-1所示接种细菌，以接种环取产毒素白喉杆菌、类白喉杆菌和待检的白喉杆菌分别以与滤纸条成垂直的方向划线接种，接种线须密且集中，接种的菌量宜多。若用此法测未知标本需设阳性对照(产毒株)及阴性对照(无毒株)，一般每个平板可接种5～6个标本。置37℃培养24、48、72h观察结果。

【结果】

注意观察在接种线两侧距滤纸条约1cm处有无与接种线呈45°角的白色沉淀线出现。有沉淀者，白喉杆菌毒力试验阳性，该菌株产生白喉外毒素；无沉淀线者，白喉杆菌毒力试验阴性，该菌株不产生白喉外毒素。

图14-1   Elek平板毒力试验

（四)动物毒力试验

【原理】

白喉外毒素对机体组织有损伤作用，使注射局部产生病变；白喉抗毒素可中和白喉外毒素的毒性。

【材料】

1．产毒素的白喉杆菌吕氏凝固血清斜面24h培养物。

2．白喉抗毒素、无菌肉汤、健康白色豚鼠。

3．注射器、针头(4号)、5ml无菌刻度吸管、碘酒、酒精、镊子、剪刀等。

【方法】

1．在菌种管内加入4～5ml无菌肉汤，轻轻将菌苔洗下，制成细菌悬液(约5亿/m1)，吸出，置于无菌试管内。

2．取健康白色豚鼠2只，分别标记为试验鼠与对照鼠。对照鼠在试验前18～24h自腹腔www.med126.com/jianyan/内注射白喉抗毒素1000u。

3．给2只豚鼠腹部剃毛，局部皮肤消毒后皮内各注射白喉杆菌悬液0.1ml。注射后24、48、72h观察注射部位的局部反应。

【结果】

试验鼠于注射局部呈现红肿与坏死，对照鼠的注射局部无明显反应。待测白喉杆菌的动物毒力试验必须设立阳性对照和阴性对照，每鼠可同时检测6～7个标本。