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生物化学-实验指导
来源:河北医科大学 更新:2013/10/14 字体:
 

<福林—酚试剂法(Lowry 法)>

<温度、pH、激动剂和抑制剂对酶活性的影响>

<基因组DNA的提取及鉴定>

 
 www.med126.com<福林—酚试剂法(Lowry 法)>

项目性质:研究性

实验学时:4

分组人数:1人

实验原理:

蛋白质中的氨酸等与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物,其颜色深浅与蛋白质含量成正比。

福林—酚法测定蛋白质的反应原理可分为两个步骤:

1.在碱性溶液中,蛋白质与铜离子发生反应:

Cu++ + 蛋白质→ Cu-蛋白质

2.Cu-蛋白质使试剂中的磷钨酸—磷钼酸还原成为蓝色化合物,测定光吸收值就可以推算出蛋白质的含量。试剂中的碳酸钠有缓冲作用,使溶液的pH值保持在10左右,显色最深。福林—酚法的灵敏度高、蛋白质浓度测定范围是25~250μg。

但此法实际上是蛋白质中酪氨酸和色氨酸等与试剂的反应,因此它受蛋白质氨基酸组成的影响,即不同蛋白质中氨基酸组成的不同会使显色强度有所差别;此外,样品中酚类及柠檬酸的干扰而使结果偏高。低浓度的尿素(约0.5%左右)、胍(0.5%医.学全在线www.med126.com左右)、硫酸钠(1%)、硝酸钠(1%)、三氯醋酸(0.5%)、乙醇(5%)、丙酮(0.5%)对显色无影响,上述物质浓度高时必须做校正曲线。

操作步骤:

1.制作标准曲线

(1) 标准蛋白的选择: 最好选择与待测样品相同或组成类似的蛋白质作为标准蛋白溶液。

(2) 标准蛋白溶液的配制:将标准蛋白经凯氏定氮法准确测定其蛋白质含量,再用无离子水配制成1.0 mg/ml的储存液。

(3) 按照表1  配成不同浓度的标准蛋白组,编上号码,以第一管为空白管,在分光光度计上测定650nm处的光密度值。

表1  不同浓度的标准蛋白组配置

1

2

3

4

5

6

标准蛋白溶液 (0.1mg/ml)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

生理盐水(ml)

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

试剂 AB混合液(9:1)(ml)

1

1

1

1

1

1

   混匀后置于50℃水浴10分钟,冷却

试剂C(ml)

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

立即混匀,置50℃水浴保温10分钟,冷却后比色。

(4)  以各标准溶液浓度为横坐标,各管的光密度值为纵坐标作图,作标准曲线。

标准曲线必须从零点出发,最好能成一直线,画好后,注明所用仪器的型号及编号,所用波长及测定方法,名称及制做日期。

2. 样品蛋白的测定: 取试管2只,按表2 操作。

   表2  样品蛋白的测定

测定管

空白管

稀释待测样品(ml)

1.0

-

生理盐水(ml)

-

1.0

试剂 AB混合液(9:1)(ml)

1

1

   混匀后置于50℃水浴10分钟,冷却

试剂C(ml)

3.0

3.0

  立即混匀,置50℃水浴保温10分钟,冷却后比色。

    注意:各管加酚试剂必须快速,并立即摇匀,不应出现浑浊;测定蛋白质的浓度最好在15~110μg范围。

试剂:

1.试剂A:2g酒石酸钾钠及100g Na2CO3 溶于500ml 1.0mol/L NaOH 中,用水稀释至1000ml。

2.试剂B:2g酒石酸钾钠及1g CuSO4.5H2O分别溶于少量水中,混合后加水至90ml再加1mol/L NaOH 10ml即成。

3.试剂C:市售的酚试剂按1:15稀释,最后浓度为0.15-0.18mol/L(用标准NaOH 滴定)。

称取Na2WO4.2H2O及Na2MoO4.2H2O 各25g溶于蒸馏水700ml中,加入85% H3PO4 50ml、浓HCl 100ml,混匀后,置圆底烧瓶中加热回流10小时,加入Li2SO4.H2O 150g、蒸馏水50ml及溴水(Br2)数滴,溶液变为红黄色,置通风橱内加热沸腾15分钟蒸发Br2,溶液呈透明的金黄色,冷却后加蒸馏水定容至1000ml,过滤,置棕色瓶中保存,用标准NaOH标定其浓度,应用时用蒸馏水稀释至浓度为0.15~0.18mol/L。

溶液中的硫酸锂能防止磷钼酸沉淀,溴可以氧化试剂中的还原物质,使其不致干扰显色。4.标准蛋白溶液:称量干燥的人血清白蛋白(BSA)或丙种球蛋白10mg,用生理盐水配制成1mg/ml的标准蛋白溶液。

5.生理盐水。

思考题:

1.Lowry 法测蛋白的反应原理及试用范围?

2.测量蛋白的方法有几种?各自的优点是什么?

5

※<温度、pH、激动剂和抑制剂对酶活性的影响>

实验性质:验证性

实验学时:4

分组人数:1

(一)实验原理

以唾液淀粉酶为例。

1. 温度对酶活性的影响

(内容原理)


(C6H10O5)n  (C6 H10O5)    C12H22O11

淀粉(胶体液乳状光泽)      糊精      麦芽糖   

(1)与碘反应呈不同颜色,蓝、紫、红等,由淀粉断裂而成大小不等情况而定。

(2)不与碘呈色,淀粉空间结构被完全破坏。 

(3)与碘反应呈蓝色(直链淀粉)。  

(技术原理)

     判断  间接判断  

碘   是否水解;水解程度     淀粉酶的活性大小  

   淀粉与碘反应后的颜色

2. pH对酶活性的影响  唾液淀粉的最适pH为6.9。

用碘判断底物淀粉消失的快慢,间接判断酶活性高低。

3. 激动剂、抑制剂对酶活性的影响。

非必需激动剂:Cl-离子

  唾液淀粉酶

强烈抑制剂:Cu2+离子

 (二)操作

1. 收集唾液

  2ml唾液

     用蒸馏水稀释  2 ml煮沸待用  

脱脂棉过滤,   2 ml(0℃-4℃水浴5分钟待用)   5~10倍  滤液  其余37℃水浴保存  

    

2. 温度对酶活性的影响

分组:见表6-36。

6-36  温度对酶活性的影响加样

步骤

管号

   1 2   3  4  备注

第1步   20滴 20滴  20滴 20滴   10g/L淀粉

第2步   0℃-4℃水浴5min 37℃水浴5min   冷温处理

第3步   预冷唾液10滴   预冷唾液10滴  唾液10滴   煮沸唾液10滴 唾液

第4步  搅匀0℃-4℃水浴5min   搅匀3 7℃水浴5min  冷温处理

第5步   2滴    37℃水浴10min 2滴   2滴  2滴   碘液 

加唾液后应混匀各管,加碘液后摇匀,观察并解释结果。

3. pH对酶活性影响

(1)分组:见表6-37。

   表6-37  pH对酶活性影响加样

管号

  加放试剂

1 2   3

磷酸盐缓冲液   pH5.0 2 ml  pH6.8 2 ml pH8.0 2 ml

10 g/L淀粉液   2 ml  2 ml   2 ml

稀释唾液   10滴  10滴  10滴


(2)比色:取瓷比色盘一个,预先在各池中分别加滴稀碘液。

每隔1分钟从第3管中吸取溶液1滴,加到已加有碘液的比色盘小池中,直至此管溶液与碘呈棕色向各试管加碘液2滴,摇匀观察。

4. 激动剂、抑制剂对酶活性的影响

(1)分组(试管):见表6-38。

表6-38  激动剂、抑制剂对酶活性的影响加样

加入试剂(滴)

1

2

3

4

备注

10 g/L 淀粉

20

20

20

20

1管加激动剂

10 g/L NaCl

2

2管加抑制剂

10 g/L CuSO4

2

3管为试验对照

10 g/L Na2SO4

2

4管为系统空白对照

蒸馏水

2

均匀置于37℃水浴

稀释唾液

10

10

10

10

(2)比色:取瓷比色盘1个,预先加入一排碘液,各池1~2滴。

 每隔1分钟从第3管吸取保温液1滴测碘反应,直至与碘呈棕色,向各试管加碘液2滴,摇匀观察。

(三)实验材料

(1)10g/L淀粉液。

(2)碘液:称取I2 1g,KI 2g,同溶于100 ml蒸馏水中,贮于棕色瓶。

(3)10g/L NaCl。

(4)10 g/L CuSO4

(5)10 g/L Na2SO4

(6)磷酸盐缓冲液

1)pH 5.0,0.2mol/L磷酸氢二钠在pH计下以0.2mol/L盐酸调节至pH5.0。

2)pH 6.8,1/15 mol/L磷酸氢二钠49.6ml加入1/15 mol/L磷酸二氢钾50.4ml。

3)pH 8.0,1/15 mol/L磷酸氢二钠94.7ml加入1/15 mol/L磷酸二氢钾5.3 ml。

(四)思考题

系统归纳温度、pH及激动剂、抑制剂对酶活性的影响。

5

※<基因组DNA的提取及鉴定>

实验性质:验证性

实验学时:4

实验分组人数:1

实验原理

从不同组织、细胞中获得高质量的DNA是进行各种研究的先决条件。DNA以核蛋白形式存在于细胞核中,制备DNA的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净、又要尽可能保持DNA分子的完整。为了获得大分子量的DNA,一般采用蛋白酶K和去污剂温和处理法。

在提取DNA的反应体系中,SDS将细胞膜、核膜破坏,并将组蛋白等从DNA分子上拉开,SDS及EDTA抑制细胞中DNA酶的活性,蛋白酶K将所有蛋白降解成小肽和氨基酸,随后用酚--氯仿抽提,将蛋白质和DNA分离,得到较纯的DNA分子。

操作

1.取动物新鲜组织约50mg,用预冷的生理盐水洗去表面残血,剪碎,加入450μl STE裂解液和50μl 10%SDS至终浓度为0.5%,匀浆后再加入10mg/ml的蛋白酶K5μl至终浓度为100μg/ml, 置55℃水浴箱保温3小时。

2.取500μl反应液加入等体积Tris·Cl(pH8.0)饱和酚,颠倒混匀10 min,4000rpm离心5min。

3.取上层粘稠水相,加入酚:氯仿∶异戊醇(25:24∶1)液至1ml,颠倒混匀10min,4000rpm离心5min。

4.取上层水相,加氯仿∶异戊醇(24∶1)液至1ml,颠倒混匀5min,4000rpm离心5min。

5.取上层水相,加1/10体积pH5.2的3M NaAC,加入预冷的无水乙醇至1ml,缓慢摇动混匀,可见乳白色丝状DNA沉淀出现,12000rpm离心15min。

6.弃上清,向沉淀中加75%乙醇500μl漂洗,12000rpm离心3min。

7.弃上清,沉淀室温干燥,加入100μlTE溶解。

实验试剂

1.STE裂解液:

 5ml 1M Nacl

0.5ml   1M Tris-cl   (PH8.0)

0.1ml   0.5M EDTA  (PH8.0)

加水定容至 50 ml。

2、10%SDS

3.10mg/ml蛋白酶K

4.Tris-HCl(pH8.0)饱和酚

5.酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)液

6.氯仿:异戊醇 (24:1)

7.3M NaAC(pH5.2)溶液

8.冷无水乙醇

9.75%乙醇

10.TE: 10mM Tris-HCl(pH7.6), 1mM EDTA(pH8.0)

注意事项

1..获得高分子质量DNA的关键之一是防止DNase降解。标本必须新鲜。在提取前,细胞应保持完整,核和溶酶体等细胞器应没有明显破坏。提取DNA用的离心管等器皿及试剂应提前消毒,操作时要尽可能在10℃以下。在提取DNA的过程中还应尽量避免DNA的机械剪切作用,因此在抽提过程中应尽可能避免剧烈振荡。

2.除组织外,外周血白细胞、胎儿羊水细胞、胎盘以及培养细胞也是大量提取DNA的最适宜来源。

思考题

1. DNA提取过程中为什么不能剧烈震荡。

2. 如何进行细胞的破碎。


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