微生态制剂对
鸡肠道微生物区系影响研究进展
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鸡的肠道栖居着大量的微生物，构成了微生物区系（微生物组)，主要是由细菌（厚壁菌门和拟杆菌)构成。肠道微生物区系对鸡的生长和健康非常重要，这些微生物区系的变化受到各种因素的影响,包括宿主本身（年龄、品种)、饲养管理、日粮水平和饲料添加剂等。过去人们就这些因素对肠道微生物区系的变化研究很多，但是研究的方法是传统的培养方法，而鸡消化道中90%的细菌用传统的培养方法不能鉴定出［1］，这样就大大限制了肠道微生物组成的研究。直到21世纪初16S rRNA目标基因分析技术在微生物研究上的应用，使人们更进一步了解复杂的肠道微生物以及它的数量、种类和结构。目前关于肠道微生物区系的多样性及具体的系统发育及功能机制仍然不是十分清楚，因此本文将近几年微生态制剂添加后对鸡肠道微生物区系影响的研究进展作一综述，以便后续的研究。 1 鸡肠道的正常菌群 宿主体内的正常菌群参与与宿主相关的生长发育、营养物质的消化吸收、合成菌体蛋白、免疫调控及生物拮抗等过程。对于鸡而言，外界环境、年龄、饲料原料和营养水平对整个菌群的变化很大，但是在正常情况下，宿主与菌群保持动态的微生态平衡。当有害菌占优势从而导致有益菌数量大大减少，这样会破坏正常菌群从而引发疾病。研究鸡肠道正常微生物菌群的种类、结构及变化过程为目前正在研究的微生态制剂提供理论基础。 1.1 胚胎期的正常菌群 以前人们一直认为胚胎期的健康鸡是处于完全无菌的空间中，但是Kizerwetter-S′wida等［2］最近研究得出在胚胎后期定居着一些革兰氏阳性菌，其中肠球菌属是优势菌，其它一些属包括
葡萄球菌、大肠杆菌、梭状芽孢杆菌、克雷伯菌、肠杆菌。 1.2 消化道前段的正常菌群及数量变化 鸡出壳后消化道微生物定植非常迅速［3］，一些肠杆菌属、肠球菌和梭菌在消化道定植。He等［4］研究得出鸡出壳后1h肠球菌和梭菌在嗉囊和腺胃中可以检测到，3日龄嗉囊和腺胃中含有链球菌、大肠杆菌和乳酸菌［5］，5日龄
鸡嗉囊中
乳酸杆菌变为优势菌。鸡开食2d后十二指肠中
乳杆菌开始出现并迅速增殖，十二指肠中微生物种类较少，其优势菌主要是乳杆菌和肠球菌。当鸡开始采食饲料到2周时乳酸杆菌在小肠定植随后发展成为优势菌群［1，6］。 Guan等［6］研究了乳酸杆菌在鸡消化道中大致的数量变化，在出生后1~7d，每克消化物中含乳酸杆菌的数量为106~109cfu，而出生8~42d后每克消化物所含乳酸杆菌的数量范围变为108~108.5cfu。空肠占优势的菌群为
双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌及真杆菌。回肠的不同部位菌群差异较大，前端靠近空肠，菌群数量较少，而回肠末端紧接
盲肠，所以菌群数量较多，且厌氧菌占大多数（>95%)。Lu等［7］得出鸡回肠里大约70%的微生物是乳杆菌属，其次是梭菌属（11%)、链球菌属（6.5%)及肠球菌属（6.5%)；且回肠分别在7~12和21~28日龄菌群结构稳定，但在整个3~49日龄期间菌群结构有显著变化。 1.3 消化道后段的正常菌群及数量变化 消化道后段菌群数量多而且复杂，优势菌群是专性厌氧菌，总量达1011个/g，盲肠要到13日龄才开始出现双歧杆菌、拟杆菌、真细菌并逐渐增加。到25日龄时盲肠内菌群才完全建立。雏鸡在30日龄时，其消化道菌群才与成年鸡一致。消化道后端的最优菌群是拟杆菌、真杆菌、双歧杆菌、消化链球菌，其次是乳杆菌、链球菌和肠杆菌等。盲肠和直肠是食物滞留的主要部位，也是细菌总量最大的部位。 2 益生菌对肠道微生物区系的影响 益生菌种类很多，主要包括乳酸菌、肠球菌、双歧杆菌、片球杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、乳球菌、大量的酵母菌及混合培养物等。关于益生菌对鸡肠道微生物区系的变化及肠道的健康的研究很多，它能够改善宿主肠道的健康［8~10］。研究证明不同的益生菌只是针对不同的病原微生物发挥作用［8，11，12］。本文分别介绍几种主要的益生菌添加后的效果及研究情况。 2.1 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌和
炭疽杆菌都属于芽孢杆菌属，芽孢杆菌作为益生菌在研究上占有很重要的位置［13］，主要表现在三个方面：一是能够产生孢子，细菌孢子能高度抵抗大量的物理应激因子，包括热、紫外线辐射、化学和真空压力；二是可以产 生较强的蛋白酶、脂肪酶和
淀粉酶，能够有效降解复杂的碳水化合物；三是芽孢杆菌类的产品的保质期、贮藏和运输条件都不复杂［14］。这些特征使得芽孢杆菌在工业生产中很受青睐。 2.1.1 枯草芽孢杆菌能有效改变肠道乳酸杆菌和大肠杆菌的数量 关于枯草芽孢杆菌能显著减少各个肠段大肠杆菌的数量许多学者的研究结果一致，而对乳酸杆菌的数量变化结果不一，Molnár等［15］研究了添加不同浓度（7.27×108~7.27×1011cfu/g)的枯草芽孢杆菌（CHCC3810~DSM17299)对肉仔鸡肠道微生物的影响，得出与对照组相比在盲肠中没有差异，但是在回肠中乳酸杆菌显著减少（P<0.05)；而Li等得出添加1×108cfu/g枯草芽孢杆菌后空肠和盲肠乳酸杆菌显著增加（P<0.05)，空肠和盲肠内容物中乳酸杆菌的数量分别提高了38.15%（P<0.05)和22.91%（P<0.05)；Zhang等［16］得出添加108cfu/g枯草芽孢杆菌UBT-MO2株后回肠和盲肠乳酸菌有增加的趋势但是变化不显著。以上这些研究结果的不同可能是枯草芽孢杆菌的不同菌株对乳酸杆菌的数量变化差异较大，再者枯草芽孢杆菌可能和乳酸菌之间存在某种具体的调控机制，有待进一步研究。 2.1.2 枯草芽孢杆菌能有效抑制肠道产气荚膜梭菌 La等［17］试验得出添加枯草芽孢杆菌后能有效的抑制鸡胃肠道远端产气荚膜梭菌的定植，使其数量减少；Sathishkumar等［18］得出枯草芽孢杆菌PB6株（ATCC~PTA6737)显著降低产气荚膜梭菌导致的
坏死性肠炎，并且使产气荚膜梭菌的数量显著降低（P<0.05)。 2.2 丁酸梭菌 丁酸梭菌是一种产丁酸、产孢子的厌氧革兰氏阳性菌，在土壤和动物小肠中都存在［19］。Yang等［20］研究得出丁酸梭菌对肉仔鸡肠道微生物有影响，2×107和3×107cfu/kg丁酸梭菌显著降低了肉仔鸡14和42日龄盲肠中大肠杆菌的数量，显著降低肉仔鸡14和42日龄盲肠中沙门菌和产气荚膜梭菌的数量，但是显著增加21和42日龄盲肠乳酸杆菌和双歧杆菌的数量（P<0.05)。Zhang等［21］证明了饲料中添加1×109cfu/kg的丁酸梭菌只增加了40日龄鸡盲肠乳酸杆菌的数量，其它有益菌没有显著变化；Zhao等［22］研究得出日粮中添加1×109cfu/kg丁酸梭菌显著减少肉仔鸡21日龄时盲肠拟杆菌的数量，Angelakis等［23］研究得出二次接种4×1010cfu/kg的乳酸杆菌也显著降低了鸡粪便中拟杆菌的数量。Yang等［20，21］也得出添加丁酸杆菌后显著增加盲肠乙酸、丁酸、戊酸及短链脂肪酸的浓度，降低了盲肠的pH值。结果表明添加丁酸梭菌对盲肠微生物区系有利。 2.3 乳酸菌和屎肠球菌 乳酸杆菌对肉鸡肠道微生物的研究很多［24~25］。乳酸菌能产生大量的有机酸，降低肠道内的pH值，抑制致病性微生物的增殖。也有研究得出乳酸杆菌的添加能够有效抑制传染性梭菌群和弯曲杆菌的数量［26~27］。Fooet等［28］和Thanh等［29］研究得出乳酸菌的代谢产物包括有机酸、抑菌素和酒精，这些物质能够控制或抑制肠道病原菌的生长，并且Loh等［30］得出其代谢产物更容易处理和保存，并且不会对肠道其它常驻有益菌产生抵抗性。 屎肠球菌是一种在肠道中正常定居的乳酸菌，能够产生乳酸和细菌素。关于屎肠球菌对动物肠道微生物的研究很多，最先是在奶牛上研究，并且有研究得出添加屎肠球菌能减少狗肠道中产气荚膜梭菌的数量、增加双歧杆菌和乳酸杆菌的水平［31，32］。Levkutet等［33，34］研究得出当肉鸡感染沙门菌后添加屎肠球菌EF55能显著减少盲肠中沙门菌的数量；Ghareeb等［35］研究得出添加屎肠球菌能降低鸡空肠中弯曲杆菌的数量；Samli等［36］发现在肉仔鸡开食料中添加屎肠球菌NCIMB10415能增加回肠中乳酸杆菌的定植。Cao等［37］最新研究得出21和28日龄的科宝公鸡与阴性对照组相比，感染大肠杆菌的阳性对照组空肠绒毛高度显著减少（P<0.05)、隐窝深度显著增加（P<0.05)，但是添加109cfu/kg的屎肠球菌的试验组与其它两组相比绒毛高度显著提高（P<0.05)、隐窝深度显著降低（P<0.05)，这与Samli等［36］和Chichlowski等［38］的研究结果一致。绒毛高度和隐窝深度是衡量动物肠道结构和营养吸收功能的两个重要指标，这说明屎肠球菌有利于改善肠道的结构、增加肠道的吸收功能，其作用机制主要是屎肠球菌通过改变pH值和空间位阻使得大肠杆菌在肠黏膜上的黏附性降低，从而避免大肠杆菌对绒毛和隐窝的损坏［24］；对于肠道微生物而言，与阴性对照组相比，添加屎肠球菌后14和28d时能显著减少大肠杆菌数量（P<0.05)，而添加抗生素组在21和28d时显著减少大肠杆菌数量（P<0.05)，这说明屎肠球菌发挥效用的时间比抗生素发生效用的时间要早；添加屎肠球菌后28d能显著减少产气荚膜梭菌的数量（P<0.05)，之前的10~21d没有显著差异（P>0.05)，这与Vahjen等［32］的研究结果相一致；与阴性对照组相比，添加屎肠球菌后21d能显著增加乳酸杆菌和双歧杆菌的数量（P>0.05)。 2.4 益生菌的添加对蛋鸡微生物区系的影响 以前关于益生菌对微生物区系的研究主要针对肉仔鸡，在蛋鸡上研究较少，近几年在蛋鸡上也进行了大量的研究。Choe等［39］研究了植物乳杆菌（COM456)对罗曼布朗母鸡粪便pH值及粪便乳酸杆菌和肠杆菌的数量影响，结果表明添加比例不同，粪便pH值显著减少的时间也不同，乳酸杆菌添加比例从0.6%~1.2%，粪便pH显著减少的时间是从23周龄开始，到29周龄结束；添加0.9%和1.2%的植物乳杆菌COM456，粪便中乳酸菌数量显著增加开始于15周龄。从这些结果可以看出乳酸菌得达到一定的比例才能对微生物区系产生影响，而且不同的比例微生物区系显著变化的时间也不同。 2.5 益生菌主要的作用模式 益生菌的作用模式很多，其中主要通过两个基本的机制来改善肠道微生物平衡和内源微生物区系，一个是竞争性排除，一方面通过竞争营养物质来产生抑制病原体的抗微生物代谢产物，另一方面通过竞争黏附位点从而使病原体无法定植，一般情况下有害微生物在肠道细胞壁的附着是其致病的前提，而益生菌在数量上的增加无疑会减少有害微生物的附着位点。Higgins等［40］和Stern等［27］研究得出益生菌能够减少沙门菌在肠道的定植率，分别减少60%和44%；Decroos等［26］和Stern等［27］研究得出乳酸杆菌的添加能够有效抑制传染性梭菌群和弯曲杆菌的数量。益生菌的菌种、菌株、提取源不同也会影响肠道特定病原菌的抑制效果。Watkins等［41］和Jin等［11］研究得出添加乳酸菌后会抑制盲肠大肠杆菌的数量，但对于其他细菌没有抑制效果，而Murry等［42］得出添加乳酸杆菌后只显著抑制了产气荚膜梭菌的数量而对其他细菌没有显著影响。另一个是免疫调节，通过先天性免疫或获得性免疫起作用，益生菌通过肠道黏膜免疫系统来对肠道微生物发挥免疫作用，而且不同的益生菌菌种、菌株其免疫调节效果也不同，Koenen等［43］就证明了不同菌株的益生菌其免疫效果的不同。 3 益生元对肠道微生物区系的影响 Gibson［44］最先对益生元给了一个定义：“不消化的食物成分，并且这些成分可通过选择刺激一个或几个肠道生理性细菌的增殖和/或活性，对宿主产生有益的健康效应”。Gilbson［45］后来又对益生元做了进一步的定义：一种选择性发酵的饲料原料导致胃肠道细菌的组成和/或者活性特异性变化，从而对宿主健康有益。大多数的益生元是由碳水化合物链所构成的可溶性纤维，相对于益生菌而言它更具有优势，因为它价格低廉、低风险、更容易处理。益生元是由一种或几种单糖（果糖、木糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、
葡萄糖)组成的低聚糖或者菊粉。功能低聚糖属于非营养性饲料原料，因为它含有β-1，4糖苷键，而且这些糖不能被肠道消化酶所水解从而可以到达后肠道被后肠道微生物所消化［45］。 3.1 低聚果糖（FOS)和
菊芋 低聚果糖是以蔗糖为原料，利用果糖基转移酶的作用，在蔗糖（G~F)分子的果糖基上通过β-2，1糖苷键结合1~3个果糖（F)而形成的蔗果三糖（GF2)、蔗果四糖（GF3)、蔗果五糖（GF4)及其混合物。它们主要存在于
大麦、
小麦、黑麦、
马铃薯、
莴苣、
香蕉、
洋葱等植物及酵母中。添加不同FOS对肠道微生物区系的变化效果也不一样，甚至当超过一定浓度，反而会使有益菌的数量下降。 Choi等［46］和Kim等［47］得出添加0.22%~0.25%FOS会显著提高双歧杆菌和乳酸杆菌的数量，显著降低产气荚膜梭菌和大肠杆菌的数量，这说明肠道不同菌种对低聚果糖的利用情况不同，乳酸杆菌和双歧杆菌能很好地利用低聚果糖，而沙门菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌等有害菌不能利用低聚果糖；当FOS添加量达到0.5%时，与对照组相比差异不显著且有益菌有降低的趋势。 Ten等［48］研究显示，添加过量的FOS会使肠道微生物的发酵速率增加过快，从而损伤肠道黏膜屏障，增加肠道的渗透性使其更容易感染有害菌。菊芋又叫洋
姜，其地下块茎含有菊糖、低聚果糖（占12%~15%)而被包括在益生元中，它是由果糖经β-2，1键连接而成的线性直链多糖，末端常带有一个葡萄糖，聚合度（DP)通常在2~60之间。 Hold等［49］研究表明洋姜显著增加了双歧杆菌、乳酸杆菌和丁酸梭菌的数量。Sritiawthai等［50］研究日粮中添加洋姜作为益生元对24周龄产蛋母鸡肠道微生物的影响，添加100mg/kg洋姜显著增加盲肠乳酸菌群的数量，从而使鸡蛋中蛋白的含量、蛋白蛋黄比率及蛋白高度显著增加。也有研究表明添加1g/kg菊粉后，产蛋后期（64~75周龄)母鸡小肠绒毛高度和隐窝深度都显著增加（P<0.05)，增加了营养物质的吸收区域；回肠和盲肠中乳酸杆菌、双歧杆菌显著增加，大肠杆菌数量显著减少，沙门菌的数目变化不大。 3.2 甘露寡糖（MOS) 从酵母细胞壁中提取的甘露寡糖（MOS)之所以成为益生元中研究的热点主要是因为它包含葡聚糖、甘露糖和蛋白组分，其中甘露糖在前消化道会发生部分水解。Spring等［51］发现在日粮中添加4000mg/kgMOS能减少盲肠中鼠
伤寒沙门菌的数量；Iji等［52］得出MOS能够减缓沙门菌导致的盲肠黏膜发炎，并且增加肠道绒毛的高度；Fernandez等［53］进一步得出MOS能够减少盲肠中沙门菌的数量，因此MOS得到很大的关注。Kim等［47］研究证实添加0.025%MOS可显著增加小肠乳酸菌的数量和显著减少大肠杆菌的数量，而总细菌数量和产气荚膜梭菌数无显著变化，当添加量达到0.05%时，这4种细菌都出现显著变化，因此0.05%MOS在改变肠道微生物区系上的效果优于0.025%MOS。由于酵母细胞壁中含有MOS和β-葡聚糖等益生元物质，所以Revathi等［54］研究了完整的酵母菌细胞壁产品（CitriStim)对鸡肠道微生物区系的影响，得出添加0.2%酵母菌细胞壁产品使得鸡42日龄时盲肠的大肠杆菌数降低了31%，沙门菌降低了20%。Bovera等［55］经分析认为MOS使得大肠杆菌和沙门菌进行了凝聚，从而抑制这些病原菌粘附于肠黏膜。 3.3 纤维寡糖（COS) 纤维寡糖（COS)是一类从植物纤维素中经过化学或者酶水解得到的由2~7个吡喃型葡萄糖单元通过β-1，4糖苷键连接在一起的寡糖，是一种新型的功能性寡糖。植物纤维素容易获取，如从
稻草、甜菜渣、紫花
苜蓿等，并且它是一种价格低廉、可再生、自然界丰富的饲料资源，利用其生产COS可以提高其利用价值，具有较高的环境效益和经济效益。Song等［56］通过在肉仔鸡日粮中添加1.5g/kgCOS显著提高空肠绒毛高度、绒毛高度与隐窝深度的比率（P<0.05)。Leeson等［57］认为COS能够水解成短链脂肪酸（SCFA)，如丁酸，而丁酸作为肠黏膜的能量来源，能够刺激肠绒毛的生长增加绒毛高度；添加COS后显著增加乳酸杆菌数、而显著降低了大肠杆菌数，但是对双歧杆菌和沙门菌没有显著影响；添加COS后黏膜免疫屏障渗透性显著降低（P<0.05)，这表明降低了病原微生物的侵入。Cheled-Shoval等［58］认为低聚糖能够模拟病原菌在肠道黏膜上的结合位点，如有些病原菌粘附在1型菌毛上，因此添加低聚糖后低聚糖直接可以与病原微生物接触，从而避免病原菌与肠道黏膜接触降低肠道内病原菌的定植。另一方面COS能够为益生菌与病原菌竞争提供有利的环境，Rodríguez-Cabezas等［59］和Hasunuma等［60］发现COS能够抵抗营养物质在小肠的消化从而使一些营养物质可以到达后肠为益生菌提供原料和营养，从而更有利于与病原菌竞争或者产生更多的酸性物质抑制病原菌的生长。 3.4 益生元的作用模式 从大量的有关益生元的研究文章得出益生元主要表现在以下几个方面的功能：一是选择性刺激有益菌在消化道后端的生长等［61，62］，动物自身分解的酶只能降解α-1，4糖苷键，而益生元分子间以β-1，2糖苷键或者β-1，4糖苷键相连，这样能以未降解的形式进入到消化道后端，然后肠道微生物就会利用其作为营养物质，并产生CO2和挥发性脂肪酸。二是抑制病原菌（大肠杆菌K99、链球菌、嗜血杆菌等)在肠道黏膜的附着等［63］。研究表明肠道病原菌必须首先与肠黏膜结合才能在胃肠道定植和繁殖而致病。这种结合是通过细菌表面外源凝集素与上皮细胞特异性的糖分子相结合,现已证实大多数肠道病原菌具有与甘露寡糖特异结合的外源凝集素；三是可以通过直接影响细胞受体或者肠道微生物的变化等改善肠道免疫功能［64］。寡聚糖也具有抗原特异性，能够产生特异性的免疫应答。 4 小结 益生菌和益生元及其它们的混合物（合生元)在维持肠道微生物区系平衡、保持肠道健康上发挥着很大的作用，但是它们具体的作用机制还没有完全研究清楚，因此在商业生产上得尽量保证其功效发挥到最大，应该从以下两个方面考虑：首先，添加的时间很重要，菌株需要一段时间来适应肠道环境，并富集到一定的数量才能产生功效，所以应该尽早地添加。其次，剂量也影响使用效果，家禽消化道中的消化液不利于某些有益菌的存活，因此需要足够的剂量来补偿肠道消化液造成的损失；但是不同的益生菌和益生元对消化道消化液的抵御能力不同，因此，针对不同的菌种，应用的剂量各不相同；对于不同病理状况下的家禽的有效剂量也不一样。
