圆环病毒2型山东分离株全基因组的克隆与序列分析
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猪圆环病毒2型山东分离株全基因组的克隆与序列分析 摘 要：根据猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因组序列，设计一对特异性引物，从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中扩增出PCV-2基因组DNA，将基因片段克隆于pMD18-T载体，筛选获得含有相应片段的阳性重组质粒pMD18-T-PCV-2。对筛选出的阳性质粒进行测序。结果表明，PCV山东株的全基因组为1 767 bp，与国内外毒株核苷酸同源性高达99.6%。关键词：猪圆环病毒2型；全基因组；克隆；序列分析猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是由Tischer等于1974年在PK-15细胞中发现的，病毒粒子为20面体对称，以滚环方式进行复制，可在PK-15细胞上生长，但不引起细胞病变。该病毒属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员。圆环病毒科是国际病毒分类委员会(ICTV)第六次学术报告会新命名的一个科，其共同特征为病毒无囊膜，基因组由一个单股呈圆环状的DNA链组成 。PCV为已知的最小的动物病毒之一 ，PCV-1和PCV-2两种血清型，两者均不产生细胞病变(cytopathic effect，CPE)。PCV-1无致病性，基因组为1 759 bp，包含7个阅读框，广泛存在于正常猪体各器官组织及猪源细胞。PCV-2基因组为1 768 bp，含有11个阅读框，目前在GenBank上发表的各毒株的序列同源性在91.9%～100%之间，
氨基酸同源性在90.2%～100%之间，比较保守 。PCV-2是断乳仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multi-systemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，自1991年PMWS在北美最先发现以来，已在世界范围内流行 。其症状主要表现为生长缓慢，贫血，呼吸困难，
黄疸等，病理变化主要为间质性
肺炎，淋巴结炎，肝炎，肾病。更重要的是PCV-2在淋巴系统增殖可导致机体免疫机能下降 5- ，造成其他病毒性、细菌性疾病的并发或继发，使病情加重。此外，PCV-2经常与多种病原混合感染 ，使疾病复杂化。PMWS既可水平传播，导致断奶仔猪发病死亡；亦可垂直传播，引起繁殖障碍 ，给养猪业带来了很大的经济损失。PCV-2只存在一个基因型(genotype)，基因组序列相对稳定，但分离自不同地区的毒株会有一定的差异 。由于现在主要应用PCR等分子生物学方法诊断PCV-2感染及研究PCV-2的发病机制，因此需对不同地区来源的PCV-2毒株基因组序列有较详细的认识，以确定其基因序列变异程度，为建立有效的PCV研究方法奠定基础。近年来，山东省也出现了与PCV-2相关的疾病病例，危害也在逐年增加。根据公开发表的PCV-2全基因组序列合成一对引物，用PCR方法从疑似病料中克隆得到PCV-2的全基因，构建重组质粒，并对其序列进行分析，探索PCV-2的变异规律，为该病毒的分子生物学、
流行病学、致病机理等相关领域的研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病料及试剂 病料来自山东某猪场疑似PMWS病死猪的组织(包括肺、淋巴结、肝以及肾)。pMD 18-T Vector购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR试剂盒(包括ExTaq酶、dNTP Mixture、10×ExTaq buffer)、DL 2 000 Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；氨苄
青霉素(Amp)、X-Gal购自Amresco公司，IPTG购自Biosharp公司；宿主菌DH5α由本室保存；DNA胶回收试剂盒购自TIANGEN公司。其余试剂均为进口或国产分析纯。1.1.2 引物 引物1：5′-GAA CCG CGG GCT GGC TGA ACT TTT GAA AGT-3′；引物2：5′-GCA CCG CGG AAA TTT CTG ACA AAC GTT ACA-3′。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，为冻干粉，用前溶于灭菌的超纯水中，稀释至100 μmol/L，工作浓度为25 pmol/μL，置－20 ℃保存。1.1.3 主要仪器 PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、低温高速离心机、台式离心机、超净工作台等。1.2 方法1.2.1 模板的制备 取0.5 mL离心病料上清，加入5 μL蛋白酶K，至终浓度为200 μg/mL，26.58 μL SDS(100 g/L)至终浓度为5 g/L,55 ℃水浴消化1.5 h，并不时摇动使混匀。加入等体积的抽提液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)抽提一次，1 000 r/min离心10 min～15 min，小心吸取上层水相至新管，并向其中加入2倍体积的冷无水
乙醇和1/10倍体积的3 mol/L NaAc混匀，置－20 ℃冰箱过夜沉淀。12 000 r/min离心20 min，弃上清。用750 mL/L冷乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心3 min，弃上清。用干净的吸水纸将残留乙醇除去，干燥10 min～15 min，将管倒立于吸水纸上。取适量用作PCR模板。1.2.2 PCR反应体系 PCR反应体系为25 μL，反应体系中加入，10×ExTaq buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，上下游引物各 0.5 μL，DNA模板3 μL，ExTaq酶 0.25 μL，加灭菌水补至25 μL。1.2.3 PCR反应条件 95 ℃预变性 9 min；94 ℃ 1 min ,65.1 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min,35个循环；72 ℃延伸 7 min。取 5 μL PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶电泳检查。1.2.4 PCR产物回收 取125 μL PCR产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，以DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按说明书操作，电泳鉴定回收的PCR产物。1.2.5 PCR产物的连接及转化 将回收的PCR产物按照常规方法 连接到pMD 18-T载体上，转化及提取质粒。反应体系为，pMD 18-T载体1 μL，Ligation solutionⅠ 5 μL，回收的PCR产物 4 μL。16 ℃水浴连接过夜。将上述连接产物加入到100 μL的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，42 ℃热激90 s迅速转移至冰浴中2 min～3 min，加入800 μL LB培养液，混匀，37 ℃振荡复苏1 h，低速离心3 min，弃去部分上清，留下200 μL 即可。将其涂于含Amp(100 mg/mL)、IPTG(24 mg/mL)、X-Gal(20 mg/mL )的LB培养基上。置37 ℃培养箱，待液体吸收后，将平皿倒置过夜培养。1.2.6 阳性重组质粒的筛选及鉴定 随机挑取上述转化平皿中的白色单菌落，接种到含Amp的LB液体培养基中，37 ℃振荡过夜至培养液呈云雾状，从菌液中提取质粒进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆。1.2.7 序列分析 阳性重组质粒由宝生物工程(大连)有限公司测序，并与其他毒株进行同源性比较。2 结果2.1 PCR扩增和菌液PCR鉴定结果扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，紫外观察，表明扩增出了1 800 bp左右的特异性片段，与预期片断大小相符。PCR扩增结果(图1)显示，在所设的4个退火温度梯度下均扩增出了目的条带，且在退火温度为65.1 ℃时，目的条带最理想。因此，选定退火温度为65.1 ℃。 2.2 PCR扩增产物的克隆将PCR扩增产物与pMD 18-T载体连接转化后，随机挑取11个单个白色菌落，过夜摇菌，提取质粒，进行PCR鉴定。鉴定结果显示，所选11个单个白色菌落均为阳性质粒2.3 序列分析序列分析表明，PCV-2 SD株全长1 767 bp，与资料报道相一致，包含分别与复制相关的Rep蛋白和结构蛋白Cap的ORF1和ORF2。应用DNA Star将其与GenBank中的已知PCV-2全基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列进行同源性比较。分析表明，所有PCV-2毒株之间同源性均很高(图3)，介于96.2%～99.8%之间。本试验所测定的PCV-2 SD毒株与EF515839株同源性最高，达到99.6%。为了更好地了解PCV毒株的遗传学特性及相互的亲缘关系，在分析所有毒株同源性的基础上绘制了系统发生进化树(图4)。从中可以看出，PCV-2分成两个独立的分支，EF619037自成一支，其余9株PCV-2关系密切，组成另一支。试验所测PCV-2 all与EF515839关系最为密切，同源性最高。 3 讨论PMWS是近10多年来出现的影响世界养猪业的重要传染病之一，PCV-2是引起该病的主要病原，但不是惟一病原，PCV-2-单独感染可出现轻微的PMWS病变。用PCV-2与猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)同时感染仔猪可复制出典型的PMWS症状 10-1 。临床上出现的PMWS病例多为PCV-2、PPV及PRRSV的混合感染。尤其是最近2年暴发的猪高致病性蓝耳病(即高致病性猪繁殖与呼吸综合征)，更是伴随有PCV-2的感染。有研究表明，将PCV-2与PRRSV混合感染3周龄健康仔猪，出现了PRRSV单独感染时所没有的病变 1 。PCV-2是否是这次猪高致病性蓝耳病暴发的帮凶，还有待于进一步的研究。PCV-2是DNA病毒，且基因组较短，可直接通过PCR方法对疑似感染的病例组织样品进行核酸检测。本研究以国内地方疑似病料为模板，克隆得到了PCV-2 基因组，并测定了全序列，所测序列长度为1 767 bp，避免了病毒分离时出现的费时费力等不利因素。目前，PCV-2已在世界范围内广泛存在，其全基因组大小有1 767 bp 和1 768 bp 两种，对于这两种基因长度的PCV-2病毒，其毒力大小还有待于进一步研究。本试验克隆得到的山东地区流行毒株与其他地区毒株的同源性均很高，与不同地区毒株之间的同源性最高可达99.8%，说明所有PCV-2 之间亲缘关系都很近，PCV-2在进化上比较保守。虽然PCV在进化上比较保守，但是引起的临床疾病却如此广泛多样，而且病毒也会随着时间的推移逐渐发生变异。国外有相关报道，病毒在传了120代过程中，发生了碱基的突变，使得病毒的复制能力提高 1 。病毒的变异会导致什么样的结果，是否会使毒力改变，是否会使致病机制发生变化，至今为止，还没有证据能够证明不同PCV-2毒株相互间致病性有何差异 15-1 。PMWS 在临床上缺乏特征性的表现， 除PCV外，还与其他病原发生混合感染， 对PCV-2毒株的基因组序列变化进行分析， 有助于了解PCV-2毒株的致病特性和变异情况。基于此，我们成功从疑似PMWS的病料中扩增出了一株PCV-2的全部基因序列。通过系统发育进化树可以看出，PCV分成PCV-1及PCV-2两个完全独立的基因型。本试验所测毒株与EF515839亲缘关系较近，处于同一分支内，这为毒株的来源提供了一定的理论依据。本研究一次性扩增出PCV-2全基因，为进一步从分子水平研究PCV-2在山东省的流行情况，致病性，致病机理，毒力变化及主要结构基因的特性等提供了科学依据。研究结果表明，目前我国PCV-2 毒株之间存在着一定的变异， 但是变异程度不大，这有利于进一步开展我国PCV-2所引起疾病的预防和控制。
