图P111 下  肽键结构

结构１中，Ｃ－Ｎ单键长0.148nm
结构２中，Ｃ＝Ｎ双键长０.127nm
结构３中，Ｃ--Ｎ键长0.132nm，６个原子几乎处在同一平面内（酰氨平面）。
肽键结构介于１和２之间（结构3），是结构1和结构2之间的平均中间状态。Ｃ－Ｎ单键具有的40%的双键性质，C═O双键具有40%的单键性质。
（3）肽键亚氨基在pH0---14内不解离。
（4）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型．

图

二、 肽的重要性质
1、 旋光性
一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。蛋白质水解得到的各种短肽，只要不发生消旋作用，也具有旋光性。
2、 肽的酸碱性质
短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。
在pH0―14范围内，肽键中的亚氨基不解离，因此肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。
在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。
肽中的末端α－COOH pK值比游离 a.a中的大一些，而末端α－Ｎ＋Ｈ３的pK值比游离氨基酸中的小一些，R基变化不大。
pK值改变的原因：
见Ｐ113、表３－８，比较表３－８中Gly-Gly和Gly-Gly-Gly

Gly—Glu—Lys—Ala的解离：

图   P113

pH    占优势离子的净电荷：
<3.5         +2
3.5-4.5        +1
4.5-7.8         0
7.8-10.2       -1
>10.2         -2
注意：占优势离子的净电荷不是全部离子的平均净电荷。

问题1：求出二肽Lys—Lys 及三肽Lys—Lys—Lys的pI值。

图

将Ｒ＋＋— 变成Ｒ＋—，就必须考虑R＋—与R（+  ，+  ，-1）等同，即侧链—N+H3解离50%，此时
图

Lys-Lys-Lys分子中有三个侧链可解离，它的R+-实际相对于R（+    ，+   ，+     ， -1  ），此时每个侧链解离后带有 1/3个正电荷。

问题2：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0? 还是等于6.0？ （小于6.0）

多肽的等电点，随着肽链内酸性氨基酸残基数的增加而下降，随着肽链内碱性氨基酸残基数的增加而上升。
多肽的等电点可以通过计算求得（如上例中），但残基数增大时，此法不行。可将肽链内酸性残基和碱性残基进行清点比较，推测等电点偏酸还是偏碱，然后用等电点聚焦电泳进行实验测定。
3、 肽的化学反应
和游离氨基酸一样，肽的α—羧基，α—氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。
凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。

图

三、 天然存在的活性肽
生物体内存在大量的多肽和寡肽，其中有很多具有很强的生物活性，称活性肽。
生物的生长、发育、细胞分化、大脑功能、免疫、生殖、衰老、病变等都涉及到活性肽。
活性肽是细胞内部、细胞间、器官间信息沟通的主要化学信使。
很多激素、抗生素都属于肽类或肽的生物。
1、 谷胱甘肽    Glu—Cys—Gly
广泛存在于动、植、微生物细胞内，在细胞内参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。
   2GSH              GS—SG

   H2O2 + 2GSH           2H2O + GS—SG
2、  短杆菌肽（抗生素）
由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。

     L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe —L-Pro—L-Val
3、 脑啡肽（5肽）
已发现几十种
      Met--- 脑啡肽：  Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
      Leu----脑啡肽：   Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu
具有镇痛作用。

1982年，中科院上海生化所用蛋白质工程技术合成了Leu---脑啡肽，既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。
     《神经生物化学》 神经多肽
生物体内多肽或寡肽的来源：
①合成蛋白质的剪切、修饰
②酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、
③动物肠道可吸收寡肽
第四节 蛋白质的一级结构（共价结构）
蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
一、 蛋白质结构层次
                一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）
                    ↓   是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序
                 二级结构
                        ↓
                    超二级结构
                        ↓
构象（高级结构）     结构域
                    ↓
                  三级结构(球状结构)
                    ↓
                  四级结构(多亚基聚集体)

一级结构：共价结构、蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)
二级结构：多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。主要有α-螺旋、β折叠、β-转角、无规卷曲。
超二级结构：由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如αα、βαβ、βββ。
结构域：大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由100-200个氨基酸残基构成。
三级结构：多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的借各种次级键维持的球状构象。
或：蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，不含亚基间或分子间的空间排列关系。
四级结构：寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。
单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。

                                
                                       RNase
                          单条肽链     肌红蛋白
               单体蛋白                胰岛素
                          多条肽链     胰凝乳蛋白酶
      蛋白质                      
                            相同亚基 一种乳酸脱氢酶α4
             
                寡聚蛋白        
                             不同亚基 血红蛋白α2β2

蛋白质一级结构(序列)中含有形成高级结构的全部需的信息，一级结构决定高级结构结构及功能。

二、 一级结构的要点
蛋白质主链由氨基酸以酰胺键连接，多肽的线性结构叫肽链，组成肽链的氨基酸叫氨基酸残基。
一级结构要点：
⑴蛋白质中的肽键都是由α-NH2和α-COOH结合生成的。
⑵每一种蛋白质都有相同的肽主链结构，各种蛋白质间的差异是蛋白质的氨基酸种类、数量及排列顺序不同。
⑶氨基酸的α-NH2和α-COOH缩合，只有末端及侧链基团有化学活性。
⑷每个蛋白质或每个蛋白质的亚基只有一个α-NH2 和α-COOH
⑸分子量大于5000的活性肽才能称为蛋白质。                             
三、 ．蛋白质一级结构测定
                      推断                       预测
氨基酸序列（一级结构）  →  空间结构 （高级结构）  → 功能    
（一） 蛋白质测序的一般步骤
祥见 P116
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。
（3） 测定多肽链的氨基酸组成。
（4） 断裂链内二硫键。
（5） 分析多肽链的N末端和C末端。
（6） 多肽链部分裂解成肽段。
（7） 测定各个肽段的氨基酸顺序
（8） 确定肽段在多肽链中的顺序。
（9） 确定多肽链中二硫键的位置。
（二） 蛋白质测序的基本策略
对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
1、 直接法（测蛋白质的序列）
两种以上特异性裂解法
              N                          C
      A 法裂解  A1    A2     A3     A4    
      B 法裂解  B1    B2     B3     B4 

用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
2、 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）
核酸测序，一次可测600-800bp
（三） 测序前的准备工作
1、 蛋白质的纯度鉴定
纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠）
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸
2、  测定分子量
        用于估算氨基酸残基n=

方法：凝胶过滤法、沉降系数法
3、 确定亚基种类及数目
多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：
⑴非共价键结合
8mol/L尿素，SDS        SDS-PAGE测分子量  
⑵二硫键结合
        过甲酸氧化：
         —S—S—+HCOOOH  →   SO3H
      β巯基乙醇还原：

举例:： 血红蛋白 (α2β2)
        （注意，人的血红蛋白α和β的N端相同。）
            分子量：  M
            拆亚基：  M1 、M2       两条带
          拆二硫键：  M1 、M2       两条带
      分子量关系：  M = 2M1 + 2M2
4、 测定氨基酸组成
主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。
确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。
①Trp测定
     对二甲基氨基苯甲醛  590nm。
②Cys 测定
     5、5/一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB ，412nm
5、 端基分析
①N端分析
DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
②C端分析
A．肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH     无水肼NH2NH2  100℃  5-10h。
                               
                          A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、  D-COOH
氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
B．羧肽酶法（Pro不能测）
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
        N   H2N… … … … …Val—Ser—Gly   C

图 P118  羧肽酶法测C末端

（四） 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
1、 化学裂解法
       ①溴化氰              —Met—X—   产率85%
       ②亚碘酰基苯甲酸      —Trp—X—   产率70-100%
       ③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—
       ④羟胺NH2OH         —Asn—Gly—
        约150个氨基酸出现一次
2、 酶法裂解
①胰蛋白酶         Lys      X
    (X ≠ Pro)          
                      Arg—— X

②胰凝乳蛋白酶     Tyr——X
     (X ≠ Pro)       
                      Trp——X

                      Phe——X

胃蛋白酶
                   Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)

③Glu蛋白酶       Glu——X
（V8蛋白酶）
④Arg蛋白酶       Arg——X

⑤Lys蛋白酶       X——Lys

⑥Pro蛋白酶       Pro——X
3、 肽段的分离纯化
①电泳法   ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
        根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）
        根据肽段的电荷特性分离
③反相ＨＰＬＣ法
        根据肽段的极性分离
④凝胶过滤
4、 肽段纯度鉴定
分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l法
要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。
（五） 肽段的序列测定及肽链的拼接
1、 Edman法
一次水解一个Ｎ端a.a
（1）耦联
        PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9 ，40℃      PTC——A-B-C-D……

（2）裂解
        PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸        ATZ—A  +  H2N—B-C-D

（3）转化
        ATZ—A                  PTH—A
           用GC或HPLC测定PTH-A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽
ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）
PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）
                    耦联：得PTC肽
        一次循环    裂解：ATZ- a.a
                    转化：PTH-a.a
        反应产率   99％   循环次数    120
        (偶联、降  98%                60
        解两步）   90%                40
2、 DNS-Edman法
用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。
       Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
       图
3、 有色Edman法
荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。
4、 用自动序列分析仪测序
仪器原理：Edman法，可测60肽。
1967液相测序仪
               自旋反应器，适于大肽段。
1971固相测序仪
              表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。
1981气相测序仪
              用Polybrene反应器。
       （聚阳离子）四级铵盐聚合物
        液相：5nmol    20-40肽    97%
        气相：5pmol     60 肽     98%
5、 肽段拼接成肽链
16肽，Ｎ端H    Ｃ端Ｓ
        Ａ法裂解：ONS  PS  EOVE  RLA  HOWT
        Ｂ法裂解：SEO  WTON  VERL  APS  HO
重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS
（六） 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定
1、 二硫键的确定（双向电泳法）
碘乙酰胺封闭-SH
胃蛋白酶酶解蛋白质
第一向电泳
过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向电泳
分离出含二硫键的两条短肽，测序
与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。
2、 酰胺的确定
Asp –Asn、Glu-Gln
酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn
举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是  Leu+    Pro0    Val-
        此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。
3、 糖、脂、磷酸基位置的确定
糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷  -0-糖苷
脂类：Ser、 Thr、Cys
磷酸：Ser、 Thr、His
经验性序列：  Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)
Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4)
四、 蛋白质的一级结构与生物功能
（一） 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能
蛋白质一级结构举例：
（1） 牛胰岛素
Sanger于1953年首次完成测序工作。
P128  图3-38
分子量：5700 dalton
51个a.a残基，A链21个残基，B链30个残基，
A链内有一个二硫键 Cys 6—Cys 11
A.B链间有二个二硫键           A.Cys 7 — B Cys 7
                               A.Cys 20—B Cys 19
（2）核糖核酸酶（RNase）

P128 图3-39
分子量：12600
        124个a.a残基
        4个链内二硫键。

牛胰RNase变性一复性实验：
P164    图3-69。

(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析，透析后构象恢复，
活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。

（3）人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构 

P129  图3-40

（二） 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。
同源蛋白质的特点：
①多肽链长度相同或相近
②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。
③除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。
通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。
1、 细胞色素C
存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。

P130，图3-41
分子量：12500左右
氨基酸残基：100个左右，单链。
25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。
60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。
亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。
亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。
人与黑猩猩         0
人与猴             1
人与狗             10
人与酵母           44
2、 胰岛素
祥见 P175  胰岛素的结构与功能

不同生物的胰岛素a.a序列中，有24个氨基酸残基位置始终不变，
A．B链上6个Cys 不变（重要性），其余18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。
其它氨基酸 对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。
（三） 蛋白质一级结构的个体差异—分子病
分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。
Linus Pauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，成人的血红蛋白是由两条相同的a链和两条相同的b链组成a2b2，镰刀形红细胞中，血红蛋白b链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。因此，当血红蛋白没有携带O2时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用(血细胞溶解)导致病血，棍棒形的血红蛋白对O2的结合力比正常的低。
以血红蛋白为例：α2β2寡聚蛋白
正常人血红蛋白，β.N......Glu 6
镰刀型贫血      β.N......Val 6
生理条件下电荷：
Va10      Glu-
疏水     亲水
人的血红蛋白分子的四条肽链中（574个氨基酸残基）只有两个Glu分子变化成Va1分子，就能发生镰刀状细胞贫血病。
（四） 一级结构的部分切除与蛋白质的激活
一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。
1、 血液凝固的机理
                    凝血因子（凝血酶原致活因子）

凝血酶原                   凝血酶
                 
   纤维蛋白原A                    纤维蛋白B         凝胶
（1）、 凝血酶原

P133  图3-43  凝血酶原的结构糖蛋白，分子量66000，582个a.a残基，单链。
在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275和Arg323—Ile324断裂，释放出274个a.a，产生活性凝血酶。
            A链49 a.a
         B链259 a.a
（2）、 纤维蛋白原

P133   图3-44  纤维蛋白原的结构

α2β2r2
α肽：600个氨基酸，β肽：461氨基酸，r肽：410个氨基酸
在凝血酶作用下，从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。

P133   纤维肽A .B的结构

A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。

P134上

在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。
2、 胰岛素原的激活
P134图3-45

胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰岛素。
五、 多肽与蛋白质的人工合成
在医药和研究方面意义重大
1958年，北大生物系合成催产素8肽。
1965年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。
1969年，美国Merrifield用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶——牛胰RNase（124aa—）。

P139图3-46  多肽的固相合成

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