P345  图5-12  tRNA的二级结构（三叶草模型）

1966年Crick对于tRNA能识别几种密码子的现象，提出碱基配对的“摆动学说”：
认为除A-U、G-C配对外，还有非标准配对，I-A、I-C、I-U，并强调密码子的5’端第1、2个碱基严格遵循标准配对，而第3个碱基可以非标准配对，具有一定程度的摆动灵活性。
四、 mRNA的结构
mRNA是从DNA上转录而来的，其功能是依据DNA的遗传信息，指导各种蛋白质的生物合成，每一种蛋白质都由一种相应的mRNA编码，细胞内 mRNA种类很多，大小不一，每种含量极低。
从功能上讲，一个基因就是一个顺反子，原核生物的mRNA是多顺反子，真核mRNA是单顺反子。
顺反子：是由顺反试验所规定的遗传单位，相当于一种蛋白质的基因。
1、 真核mRNA
（1）、 3’-端有一段约30-300核苷酸的polyA。
PolyA是转录后，经polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶对mRNA专一。
原核mRNA一般无polyA。polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。
polyA功能：
PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。
PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。
（2）、 5’-帽子帽子
5’末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5’-5’-磷酸二酯键。
P346   帽子结构

帽子的功能：
可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。
可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。
2、 原核mRNA（多顺反子）
原核mRNA由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5/帽子和3/polyA。
举列：MS2病毒mRNA，3569 b，有三个顺反子，分别编码A蛋白、外壳蛋白和复制酶三种蛋白质。

          图MS2病mRNA

5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。
SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补，这种互补序列与mRNA对核糖体的识别有关。
原核mRNA代谢很快，半寿期几秒至十几分钟。
五、 rRNA的结构
rRNA占总RNA的80%左右。
功能：rRNA是构成核糖体的骨架，与核糖体结合蛋白一起构成核糖体，为蛋白质的合成提供场所。
大肠杆菌中有三类rRNA（原核）
5S rRNA
16S rRNA
23S rRNA
真核细胞有四类rRNA
5S rRNA
5.8S rRNA
18S rRNA
28S rRNA

          图  原核核糖体（rRNA 部分）

          图   真核核糖体（rRNA部分）

P346  图5-14   大肠杆菌  5S rRNA  结构
第四节   核酸的性质
一、 解离性质
多聚核苷酸有两类可解离的基团：磷酸和碱基能发生两性解离。
磷酸是中等强度的酸，碱基的碱性较弱，因此，核酸等电点在较低的pH范围内。
DNA等电点  4—4.5
RNA 等电点 2—2.5
RNA链中，核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链，促进磷酸酯羟基氢原子的解离。
二、 水解性质
1、 碱水解
室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。
         图

在相同条件下，DNA不被水解。这是因为RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。
DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。
DNA稳定 ，遗传信息。
RNA是DNA的信使，完成任务后降解。
2、 酶水解
生物体内存在多种核酸水解酶
RNA水解酶  RNase
DNA水解酶  DNase
核酸外一切酶
核酸内切酶  最重要的：限制性核酸内切酶
三、 光吸收性
碱基具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，　　　　λmax=260nm
1、 鉴定纯度
纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。
纯RNA的A260/A280应为2.0。
若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。
2、 含量计算
1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA
                  或：40ug/mL单螺旋DNA（或RNA）
                  或：20ug/mL核苷酸
3、 增色效应与减色效应
P347  图5-15  DNA的紫外吸收光谱

增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大
减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。
四、 沉降特性（DNA）
不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。

      P348 图5—16  Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA

相对沉降常数
线型双螺旋分子                1.00
松驰双链闭环                  1.14
切刻双链环                    1.14
单链环                        1.14
线型单链                      1.30
正超或负超螺旋双链环状        1.41
坍缩                          3.0

五、 变性、复性及杂交
变性、复性是核酸的重要的物化性质，相对蛋白质来说，核酸可以耐受反反复复的变性、复性。这也是核酸研究技术的基础。
1、 变性
（1）、 变性：
核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。
DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。
P350  图5-18变性过程

          热变性
因素      酸碱变性（pH小于4或大于11，碱基间氢键全部断裂）
           变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） 
             260nm吸收值升高。
   变性后   粘度降低，浮力密度升高。
               二级结构改变，部分失活。  
（2）、 熔解温度（Tm）或称熔点：
DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在70—85℃之间。
浓度50ug/mL时，双链DNA  A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。
（3）、 影响DNA的Tm值的因素
①DNA均一性   均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围
内。
②G-C含量与Tm值成正比，G-C含量高，则Tm越高，测定Tm，可推知G-C含量。。
G-C%=（Tm-69.3）×2.44

P351图5-19     图5-20   Tm值与GC含量的关系
③介质中离子强度
其它条件不变，离子强度高，Tm高。
P351    图5-21
2、 复性
变性DNA在适当（一般低于Tm20—25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。
变性DNA在缓慢冷却时（快速冷却可防止复性），可以复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。
复性速度可用Co·t衡量。
Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。

P352  图5-22，不同DNA的复性时间。

A．1个核苷酸对（A.U）
图上查出Cot1/2=4×10-6mol.s/L
若浓度为Co=1.0m mol/L
则复性50%所需时间t=0.004秒
若要全部复性，Cot=10-4  t=0.1秒
B．E.coli  4.2×106碱基对
图上查出Cot1/2=10 mol.s/L
若浓度Co=1.0 umol/L则复性50%所需时间t=107秒，约115天。复性100%Cot=500 mol.s/L
t=5×108秒，5758天。
对于E.coli ，4.2×106bp，浓度达到umol/L级时，浓度已很高。 
复性机制：10-20bp成、拉链
3、 杂交（DNA—DNA、 DNA—RNA）
将不同来源的DNA混合加热，变性后，慢慢冷却使它复性。若这些异源DNA之间，在某些区域有相同的序列，则复性时会形成杂交分子。
第五节 核酸研究技术
一、 核酸的分离纯化
要求：尽可能保持其天然状态。
       条件温和，防止过酸、过碱。
      避免剧烈搅拌，抑制核酸酶。
1、 DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。
DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。
2、 RNA的制备（重点介绍mRNA的分离、纯化）
用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。
去蛋白：盐酸胍、苯酚等
必须防止RNA酶对RNA的破坏。
二、 核酸的凝胶电泳
1、 琼脂糖电泳
① 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比
② 凝胶浓度
③ DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。
④ 电流，不大于5V/cm
2、 PAGE电泳
三、 限制性核酸内切酶（1979年发现）
1、 限制修饰系统
         图

2、 II型核酸内切酶
核酸内切酶有I、II、III三种类型，其中II型酶在DNA克隆中十分有用。
II型酶的特点：限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。
II型酶的切割频率
识别位点 4       44=256
                6       46=4096
                8       48=65536

Not I    GCGGCCGC
限制酶的命名：E.coRI
第一位：      属名E（大写）
第二、三位：  种名的头两个字母小写co
第四位：      菌株R
第五位：      罗马字，从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。
同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。
BamH：  GGATCC       同裂酶 BstI
识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。
同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。
BamHI：GGATCC
同裂酶：BstI GGATCC

同尾酶：BclI  TGATCA   BglII  AGATCT

MboI  GATC    Sau3A  GATC
星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。

例如  HindIII   AAGCTT

四、 DNA物理图谱及构建
（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）
在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础，末端标记法构建DNA物理图谱：
（1）单酶完全降解和部分降解
（2）双酶降解

         图
五、 分子杂交
1、 Southern Blotting
P353 图5-23
DNA样品        酶切         电泳           变性         转膜          固定         杂交           洗涤              放射自显影
变性（NaOH 0.5mol/L）
转膜（NC膜）
固定（80℃，4-6h）
杂交（高盐浓度，68℃，几小时）
Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。
可用DNA或RNA探针。
2、 Northern Blotting
研究对象是mRNA
检测可与探针DNA同源杂交的mRNA分子的存在，因而可以研究细胞内特定mRNA的产生，即特定基因的表达。
mRNA易形成局部二级结构，因此，总RNA或mRNA需在变性条件下电泳，乙二醛、甲醛可防止RNA形成二级结构。
3、 Western Blotting
是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。
六、 DNA序列分析
（一） 化学裂解法（Maxam-Gilbert 法）
DNA一级结构测定原理：
利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离。
一定浓度的特测片段
                       32P-GCTACGTA
特异性化学裂解
在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT
在G处：32p-GCTA
在C处：32P-G和 32P-GCTA
在T处：32P-GC和32P-GCTACG
        图

硫酸二甲酯特异切割：G
甲酸特异切割：G和A
肼在Nacl条件下切割：C
肼在无 Nacl条件下切割：T和C
32P *ACTTCGACAA
硫酸二甲酯：   *ACTTC
甲酸：         *P
               *ACTTC
*ACTTCG
*ACTTCGAC
                *ACTTCGACA
肼（有Nacl）：  *A
               *ACTT
               *ACTTCGA
肼（无Nacl）：  *A    
*AC   
*ACT
                *ACTT
*ACTTCGA
从下往上读：CTACGTA
末端G不能读出。
（二） 双脱氧终止法
英国   Sanger
     1955  确定牛胰岛素结构
     1958  获诺贝尔化学奖
     1980  设计出DNA测序法
     1980  再获诺贝尔化学奖
合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
         图

胰岛素的基因工程：A链21a.a   63个核苷酸
                  B链30a.a   90个核苷酸
（三） 序列分析仪
四色荧光基团标记的ddNTP
七、 DNA合成（合成探针、引物、基因）
1、 化学合成——DNA合成仪
DNA固相合成（亚磷酸三酯法）
合成方向：3’        5’端
5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护，
碱基上氨基用苯甲酸保护
3’-OH用氨基磷酸化合物活化

P353  合成过程

保护： 5’-OH、活化3’-OH、保护所有NH2
2、 DNA的酶合成——PCR
用DNA聚合酶I
必备条件：
①模板DNA（单链）
②引物
③DNA聚合酶
④dATP、 dGTP、dCTP、dTTP
⑤一定浓度的Mg2+
链合成方向：5  ’      3’端
新的DNA链合成，从引物DNA的3’-OH开始。
          图

链的增长反应是引物DNA的3’-OH，对脱氧核糖核苷三磷酸的α-磷原子亲核进攻的结果。
化学合成：方向3’     5’，不需DNA模板，不用酶。
生物合成：方向5’     3’，需模板，引物，用酶。

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