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蛋白质一级结构的测定方法
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

  研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构棗氨基酸算起,已有150年的悠久历史,直到1955年,Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序,为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。目前关于核酸的一级结构研究,由于Sanger等发明了加减法,可以得到了突飞猛进的发展。对此之下,关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸迅速。但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱质谱(GCMS)等方法的相继出现。使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少,而且工作人员也大大减少。当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间,今天运用自动化仪器,分析一个分子量在10万左右的蛋白质只需要几天,可见新技术的应用和发展对科学发展起的促进作用,蛋白质一级结构测定方法的综述及专著文献较多,这里只扼要加以概述。

  蛋白质分子的一级结构测定,概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及-S-S-定位等。

  一级结构的测定方法可概述如下:

  1.多肽链的分离

  在测定一个蛋白质的结构以前,首先必须保证被测蛋白质的纯度,使结果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基数,按照其亚基数将蛋白质分成几个多肽链。

  1)肽链的拆开

  蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多肽链,必须采用的化学处理方法常有:

  ①过甲酸氧化

  用氧化剂过甲酸断裂-S-S-。这个反应一般在0℃下进行2小时左右,两个S就全部能转变成磺酸基,这样被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸。

  如果蛋白质分子中同时存在半胱胺酸,那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化,从而增加分析的复杂性。

  ②巯基乙醇还原

  利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。当高浓度的巯基乙醇在pH8?条件下室温保温几小时后,可以使-S-S-定量还原为桽H。与此同时反应系统中还需要有8摩尔脲或6摩尔盐酸胍使蛋白质变性,多肽链松散成为无规则的构型,此时还原剂就可作用于-S-S-。此反应是可逆的,因此要使反应完全,疏基乙醇的浓度必需在0.1-0.5摩尔。

  ③Cleland试剂的还原作用

  Cleland′s指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试剂,只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原,反应基本与疏基乙醇相似,且在许多球蛋白反应中,可以不用变性剂。

  Cleland试剂首先与蛋白质-S-S-形成中间物,反应终了,还原剂被氧化形成一个稳定的六环化合物,蛋白质则被还原。

  还原蛋白不稳定,SH基极易氧化重新生成-S-S-键。稳定SH基的方法有:

  (A)烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物。

  如果碘代乙酰胺代替碘代乙酸,其产物S羧氨甲基衍生物不带电荷,磺代乙酸也可与组氨酸、蛋氨酸和赖氨酸发生反应,但反应条件不同,可通过各种pH及反应时间进行控制。

  (B)氨乙基化

  蛋白质分子的几条肽链若以非共价健结合,则用尿素、盐酸胍等变性剂即可拆开。蛋白质的多肽链被拆开后,将它分离纯化,一般多用凝胶过滤、离子交换、电泳等方法,兹不赘述。

  分离纯化后的每条肽链还要进一步分析其末端。

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