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 医学全在线 > 理论教学 > 基础学科 > 免疫细胞与核酸分子杂交 > 正文
非放射性标记的核酸探针
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

 

  三、生物素-补骨脂素(Biotin -psoralen)标记法

  生物素-补骨脂素是另一种生物素光敏物质,在长波长紫外线照射下与嘧啶碱基发生光化学反应,加成到DNA中,去除小分子后,得到生物素标记核酸探针。此法可标记单链或双链DNA或RNA,及寡核苷酸。灵敏度与放射性探针相当。标记方法:取DNA或片段0.5μg加50μlTE(pH8.0)缓冲液中,再加入5μlg生物素-补骨脂素,溶解后,置365nm紫外光下直接照射20min,距离5cm,加等体积TE,移入用TE平衡的Sephadex G—50 柱(高1.0cm),离心法过柱,收集液体即为Bio –DNA探针。

  四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法

  此法是在亚硫酸盐催化下,生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基,使生物素结合到DNA分子上而制成生物素化DNA探针。此法优点是采用通用试剂和技术,检出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰,此过程也可能介导C-6位的磺酸盐组分。在合适的条件下,可有3%~4%的碱基被修饰。新鲜配制亚硫酸氢钠-乙二胺混合液,两者混合液含量分别为1mol/L和3mol/l (pH6.0),加入对苯二酚,使终浓度为1mg/ml。将DNA用超声打成500~800bp长度的片段,煮沸法变性,取1份DNA与9份上述混合液混合,42℃水浴3.5h。用5mmol/L磷酸钠缓冲液(pH8.5)在40℃下充分透析,浓缩DNA,再溶于200μl 0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH8.5),再加入4mmol/L生物素-ε-氨基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂,室温反应2h,用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)在40℃下充分透析,纯化,-20℃保存。医学全在线www.med126.com

  五、缺口平移法标记生物素DNA探针(二步法)

  取HBV质粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl,三蒸水补足体积至10μl,37℃,15min;加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio –11- dUTP各2μl,10×NBt 4μl,三蒸水补足体积至10μl,37℃,15min;三蒸水补足体积至49μl,DNA聚合酶i 5u,混匀,14℃过夜,加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl终止反应。

  已标记探针的提纯:10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris –HCl (pH7.5) 150μl,2.5倍体积的95%乙醇,置液氮中15min或-20℃过夜。15000r/min,离心10min,真空干燥后,溶于适量三蒸水中,即为纯化的探针,-20℃备用。

  使用闭环或线性双链质粒DNA,或分离的双链DNA片段均可进行此法标记,全质粒标记敏感性较高,因为标记物可同时掺入载体DNA。

  此法也可用于放射性同位素和地辛标记DNA法。

  六、生物素随机引物标记探针方法

  以HBV DNA为例。取HBv DNA质粒0.5μg,随机引物(Pharmacia)2μg,用TE(pH8.0)补足体积至10μl;100℃,热变性5min,骤冷10min。加10×缓冲液(500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl2, 10mmol/L β巯基乙醇),BSa 500μg/ml 5μl,5mmol/l dATP/dGTP dCTP各1μl,按不同比例加入Bio –11-Dutp,和dTTP,用三蒸水补足体积至48μl,加DNA聚合酶(SABC)8u,混匀,37,2h,加0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2μl,终止反应。

  在随机引物标记体系中,加入不同梯度浓度比值的Bio-11-dUTP/dTTP(%),发现二者比值明显影响探针标记率和显色灵敏度。Bio-11-Dutp/dTTP(%)比值为35%时,其标记率最高,显色灵敏度达0.2pg,杂交灵敏度为1~2pg。二步法缺口平移标记HBv DNA探针,其灵敏度低于随机引物标记。Mackeg等(Focus,1992;14:21)证实了用随机引物标记探针具有放大的效应。随机引物中加入一定比例的dTTP,能增加HBv DNA探针的标记率和灵敏度。其灵敏度接近同位素标记探针的灵敏度。

  七、异羟基洋地黄毒甙(Digoxigenin)标记核酸探针

  1988年德国Boehringer Manheims公司推出了一种地高辛标记DNA检测试剂盒。先将地高辛甙元通过一手臂联接至dUTP上,用随机引物法标记DNA制成探针。平均每20~25个核苷酸中标记一个地高辛甙元,然后用抗地高辛抗体的Fab片段与碱性磷酸酶的复合物和NBt – BCIP底物显色检测,灵敏度达0.1pg DNA,因此可做1μg哺乳动物DNA中单拷贝基因分析。此种探针有高度的灵敏性和特异性,安全稳定,操作简便,可避免内源性干扰,是一种很有推广价值的非放射性标记探针。

  标记方法步骤:(1)取一小离心管(0.5ml)插入冰浴中,加入待标记DNa 1μg/5μl,95℃变性10min,迅速移入盐冰中3min。加入六核苷酸引物2μl,Dig-dNTP标记物2μl和消毒双蒸水10μl、大肠杆菌DNA聚合酶i Klenow片段1μl(单位)。(2)短时离心,37℃孵育至少60min(20h以内)。(3)加入2μl 0.2mol/L EDTA溶液中止反应。再加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl预冷的乙醇(-20℃),放入-70至少30min或-20过夜。(4)离心(12000g)10min,弃上清,再加入70%乙醇(冷)40μl洗一次,离心,抽干,再溶于50μl TE溶液(pH8.0)中,分装,-20℃存放备用。

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