微 信 题 库 搜 索
理论教学
内科学
风湿病学 神经病学 免疫与健康
儿科学 老年医学 更多
外科学
皮肤性病学 普通外科学 烧伤外科学
神经外科学 外科学总论 更多
其它科目
基础学科 临床专科 内科疾病
内科诊疗 外科诊疗 专科诊疗
外科疾病 专科疾病 临床专科疾病
 医学全在线 > 理论教学 > 基础学科 > 免疫细胞与核酸分子杂交 > 正文
非放射性标记的核酸探针
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

 

  八、光敏2,4-二硝基苯(光敏DNP)标记DNA法

  光敏DNP由一连接臂组成,一端是2,4-二硝基苯,另一端有芳基叠氮化合物。此法适用于含氨基检测基团。其敏感性和光敏生物素标记探针相同,检测时需要抗DNP抗体和免疫化学显色。标记方法:(1)DNA不心变性,必须溶于水中,取2~10μg10μl,加入二甲亚砜25μl,每微克DNA加入光敏DNp 2μg(在避光条件下),混匀。(2)置入冰浴中,在特制灯10cm下照射10min。(3)加入水165μl,4mol/L醋酸钠20μl和异丙醇50μl,混匀。(4)用705和无水乙醇沉淀各一次,晾干,按50μg/ml溶于200μl水中,如探针不溶时,可在60℃水溶中加热10min,离心5min,除去不溶性杂质,分装,-20℃可保存1~2年。此法简便,不仅适用于核酸标记,也适用于蛋白质标记。

  九、三硝基苯磺酸(TNBS)标记核酸探针

  在温和的条件下,TNBS将核酸的胞嘧啶转化为N-甲氧基-5,6-二氢嘧啶-6-磺酸盐衍生物,对胞嘧啶残基进行磺化修饰制成磺化半抗原探针。此法十分简便,也可用于蛋白质的标记。标记方法:取变性单链的DNA5μg,溶于0.02mol/L硼酸钠缓冲液(pH8.6)中,加入TNBS5μg溶解,在室温中反应1h。移入冰浴中,加入无水乙醇和70%乙醇各洗1次,晾干,用50μl消毒双蒸水溶解,分装,-20℃保存备用。

  十、生物素化的RNA探针标记

  RNA探针比cDNA探针的敏感性提高10倍以上,在许多优点。它们是单链,不需变性,也没有互补链的干扰,与靶基因杂交比DNA探针更稳定。Bio-11-dUTP可通过Sp6、T3和T7RNA聚合酶掺入到RNA转录子中。标记方法:其下列反应体积为50μl:40mmol/l Tris HCl pH8.0、8mmol/l MgCl2、2mmol/L亚精胺、25mmol/l NaCl, 1mmol/L每一ATP、GTP、GTP,1mmol/L生物素Bio-11-Dutp,500ng模板,45u T3RNA聚合酶。混合,37℃反应1h。加入10%SDS终止反应。凝胶过滤分离标记RNA探针。

  十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法

  此法标记原理如下图所示:

  标记的HRP部分催化底物化学发光反应:氨基苯二甲酰肼 氨基苯二甲酸

  +N2+光→X-光片上感光10~20min显定影。

  光亮子在酚、萘及胺类等增强剂促进下,而使光亮增强。

  这种方法就是利用特殊的酶底物,氧化后把产生的能量转变为光能放出,称为化学发光。杂交后与探针结合的酶催化相应的发光剂,经增强剂将光能放大,在X光片上显示杂交信号。此方法灵敏度与同位素标记水平相当,简便快速,安全,是一种特异性好的检测手段,具有广泛的应用前景。

  HBV-DNA的HRP标记方法:质粒中插入HBV全基因组DNA,长3.2kb,载体为PBR322质粒,4.3kb。将质粒DNA用三蒸水稀释成10ng/μl,取20μl放入EP管,100℃变性5min,加入20u HRP标记试剂,混匀,加入戊二醛20μl混匀,37℃10min,此时可立即使用,或放在冰浴中10~15min内使用,或加入50%去离子甘油-20℃保存供分子杂交用,可存放6个月。

  十二、用聚合酶链反应标记高活性DNA探针

  聚合酶链反应(PCR)或称体外基因倍增技术,它利用一对位于待扩增的DNA序列两端的取向相对的DNA引物,在DNA聚合酶的介导下,经过多次变性,退火和延伸过程的重复性循环,大量合成靶DNA序列。在标记dNTP存在时,经PCR反应产生的靶DNA片段均参入了标记物,用此法标记的探针标记率高达97.4%。此法重复性好,简便、快速、特异、不要求模板DNA的纯度,可以大量制备。此法有普遍应用价值。

  标记方法如下:待标DNA模板1ng,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/L MgCl2 dATP、dCTP、dGTP各200μmol/l dTTP150μmol/Ll,Bio-11-dUTP 50μmol./L, 引物各1μmol/L,明胶200μg/ml,2u Taq DAN聚合酶,总反应体积为100μl。混匀后,加石蜡油封顶,94℃和55℃各2min,72℃3min,经25个循环后,可产生5~10μg标记探针,需时仅4h。乙醇沉淀扩增的产物后,溶于100μl TE中,分装-20℃。

上一页  [1] [2] [3] [4]  下一页

相关文章
第二节 肺栓塞放射学检查与诊断
放射性肠炎
放射病(radiation disease)
放射生物学研究中实验动物的选择和应用
198-4 放射性核素显像
   触屏版       电脑版       全站搜索       网站导航   
版权所有:医学全在线(m.med126.com)
   触屏版       电脑版       搜索   
版权所有:医学全在线(m.med126.com)
网站首页
频道导航
医学论坛
返回顶部