三、肝癌免疫细胞化学
原发性肝细胞癌（简称肝癌)是世界上较常见的恶性肿瘤之一，特别在非洲和亚洲一些地区肝癌发病率较高。自从发现乙型肝炎抗原（HBAg)以来，给HBV与肝癌发病关系的研究开辟了新的途径。近年来用免疫细胞化学技术及分子杂交技术对HBV与肝癌发病关系的研究更加深入和广泛，并取得一定成果。全世界各地通过大量的流行病学、免疫病理学、分子遗传学等研究结果表明，HBV感染与肝癌的发病有密切关系，普遍认为HBV是肝癌发病的主要原因。目前尚不完全清楚HBV致癌机理，是具有直接致癌作用或间接致癌作用，这有待进一步研究。
（一)HBV与原发性肝癌的流行病学证据
HBV与原发性肝癌关系的研究已有20余年，目前对HBV作为肝癌病因的证据日益增多，特别是对HBV的分子生物学的研究表明，HBV可能具有直接致癌作用。如下事实可作为临床学和流行病学的证据：
（1)原发性肝癌常发生在HBV流行区，而非流行区则发病率很低。
（2)血清学研究表明：生活在HBV流行区的肝癌病人50%～90%HBsAg阳性，而对照组仅为5%～15%；抗-HBc为80%～90%，而对照组为15%～35%。近年来研究表明，肝癌病人抗-GBx的检出率在85%左右。而对照组很低。些标志物被认为是目前正在发生HBV感染或先前有HBV持续感染的证据。甚至在欧美肝癌发病率很低的国家，肝癌病人HBsAg，抗-HBc和抗-HBx检出率也明显比对照组高。从大量的研究结果表明，在HBV流行区HBV携带者肝癌发病的相对危险性比非携带者高十倍，甚至几百倍。
（3)在HBV流行的人群中，HBV携带者与肝癌家庭聚集性的早期观察，生活早期婴儿从母亲传播感染是HBV慢性携带者，后代亦易成为慢性携带者。Larouze 等发现塞内加尔患肝癌的母亲中71%HBsAg阳性，而相应的对照组仅为13%，在朝鲜和我国台湾省也观察到同样的现象。预防母-婴的HBV传播，对预防肝癌的发生具有重要意义，从研究家族病例来看，大多数最终发生肝癌的个体在出生时或是出生后第一年内从携带HBV的母亲或兄弟姐妹间获得感染。
（4)约80%的肝癌病例发生在肝硬变或慢性活动性肝炎的基础上，而肝硬变和慢性活动性肝炎双往往由HBV慢性持续性感染引起的。在亚洲和非洲一些地区，肝硬变病人90%以上HBsAg阳性，慢性活动性肝炎病人75%以上HBsAg阳性，而对照组只有6%～14%HBsAg阳性。
（二)肝硬变与肝癌的关系
大多数肝癌病合并有肝硬变，部分肝硬变病人可发展为肝癌，这一事实早已被人们所注意。大多数报道肝癌合并肝硬变为80%～90%。肝癌合并肝硬变的类型主要为坏死后大结节 型肝硬变，约占70%～80%，少数为混合型，合并小结节 型肝硬变少见。肝硬变发展为肝癌的百分率，各报道差别较大，但大多数报道为20%左右。坏死后大结节 型肝硬变与乙型肝炎病毒感染有密切关系，HBsAg阳性率很高，达70%～80%。Blumberg等（1977)报道在84例肝硬变中有24例HBsAg阳性，其中6例（25%)发展成肝癌。Obata(1980)指出，HBsAg阳性的肝硬变有23%发生癌变，Nayak（1977)报道，肝硬变发生癌变的机会和其HBsAg阳性有关，HBsAg阳性的肝硬变发生肝癌的机会为51%，而与HBsAg阳性的大结节 型肝硬变有密切关系。大结节 型肝硬变常伴有肝细胞的不典型增生，而伴有不典型增生的肝硬变HBsAg阳性检出率很高，表明肝细胞不典型增生与HBsAg慢性持续感染有密切关系。有人认为不典型增生的肝细胞是一种癌前期病变。
（三)肝细胞肝癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布
目前用组织化学、免疫组织化学及免疫电镜等技术可以在人肝癌及癌旁肝细胞内检测到HBsAg、前S1、前S2、HBcAg(HBeAg)及HBxAg等。
1．肝癌及癌周肝组织内HBsAg定位及分布在肝癌组织内，HBsAg阳性率一般来说比较低，大多数报道其阳性率在10%～15%，少数报道阳性率可高达25～44%。肝癌细胞内HB－sAg阳性主要见于分化好的肝癌病例，少数亦见于中度分化及分化差的肝癌病例。一般来说，癌周肝组织内HBsAg阳性率明显高于癌组织。大多数文献报道，癌周肝组织内HBsAg阳性率为60%～80%，少数报道在90%以上。癌周肝组织内HBsAg阳性主要见于癌周肝硬变中，特别是大结节 肝硬变中。这一结果表明，HBV与肝癌的发生有密切关系。肝癌及癌周肝组织内HBsAg阳性的形态和分布状态，不同病例表现不同，就是同一病例不同部位也有很大差异。HBsAg阳性细胞分布亦不规律。绝大多数HBsAg阳性物质位于胞浆内，部分位于胞膜上，少数位于核内。HBsAg阳性物质呈细颗粒状、絮状或网状。HBsAg阳性物质在细胞内分布有三种类型：全胞浆型，阳性物质充满整个胞浆；包涵体型，阳性物质集聚成团，位于核旁一侧；胞周型或核周型，阳性物质沿着泡膜或核膜分布，呈环状。在肝癌及癌周肝组织内包涵体型或全胞浆型较多见。HBsAg阳性细胞的分布有三种类型：弥漫型，多数阳性细胞弥漫分布于切片内；局灶型，少数阳性细胞集聚于某一区域；散在型，阳性细胞较少，孤立的或零散的分布于切片内。一般来说，癌周肝组织HBsAg阳性反应强度和阳性细胞检出率比癌组织高。癌组织检出率低的原因，可能是由于癌组织不适于HBsAg的复制，或是由于HBv DNA和宿主DNA发生整合，而HBsAg不易表达所致。至于HBsAg在肝癌发病中的作用，目前尚不清楚。一般认为HBsAg作为靶抗原，通过免疫反应，造成肝细胞的损伤，肝细胞增生，不典型增生，最终可能导致癌变。
2．肝癌及癌周肝组织内前S抗原的定位及分布对肝癌及癌周肝组织内前S（pre-S1和pre-S2)抗原的研究远不及对HBsAg的研究。近来，国内外文献有少数报道。在肝癌组织内前S1和前S2抗原的检出率为20%左右，略比HBsAg检出率高。在癌周肝组织前S1和前S2抗原的检出率为60%左右，这个和HBsAg的检出率基本相似。在绝大多数HBsAg阳性的病例前S1和前S2抗原亦阳性，而在部分前S1和前S2阳性病例，HBsAg却呈阴性反应。因为在基因构成上，前S1包括前S2和HBsAg，前S2包括HBsAg的部分，故前S1和前S2的表达要比HB－sAg强。用免疫组化方法染色，前S1和前S2阳性物质呈棕红色呈均匀细颗粒状，主要位于癌细胞及肝细胞的胞浆内，有些病例则和/或位于胞膜上及核内。阳性物质反应的强弱和前S1或前S2抗原的含量有关。一般来说，前S1或前S2阳性反应强度和阳性细胞检出率，癌周肝组织比癌组织强。这一规律和HBsAg相同。前S1或前S2阳性物质在细胞内的分布情况及其阳性细胞分布状态和HBsAg的基本相似。目前对前S1或前S2抗原在肝癌发病中的作用尚不完全清楚。有人研究证明，在人肝细胞膜上存在两种不同的受体，一种受体可以直接与前S1蛋白结合；另一种受体通过多聚人血清白蛋白（PHSA)与前S2蛋白结合。所以HBV通过PHSA介质结合在肝细胞上，从而形成靶抗原，通过免疫反应引起肝细胞的损伤，进而可能发生肝细胞的增生，不典型增生，最终导致癌变。
3．肝癌及癌周肝组织内HBcAg(HBeAg)的定位及分布到目前为止，在肝癌细胞内发现有HBcAg只有少数报道。所有的报道，HBcAg的检出率都不太高，大多在10%～20%左右。HBcAg和HBeAg在肝癌及癌周肝组织内不易检出或检出率较低的原因，可能是由于HBcAg 和抗HBc常以免疫复合物的形式存在于胞核内，HBcAg被封闭之故；亦可能由于HBcAg基因和宿主基因进行了整合，使HBcAg不再表达出来。HBcAg和HBeAg经常并存，因此HBeAg亦经常不易单独检出。HBcAg或HBeAg阳性物质呈均匀细颗粒状分布于胞核内，少数见于核仁内。位于核内常呈圆形或卵圆形，围绕核仁占据整个核或占据核的大部分。少数病例HBcAg阳性物质位于胞浆内或胞膜上，有的病例核、膜及浆内同时阳性。HBcAg阳性细胞的分布与HBsAg的分布相似。
关于肝癌的免疫学方面的研究，血清学方面的研究较多，组织学研究的较少。大量的流行病学和临床学方面的资料表明，肝癌患者血清中抗-HBc明显高于对照组，其阳性率高达70%～95%。用免疫组化技术在肝癌及癌旁肝组织内亦发现有抗-HBc的存在。有人证实抗-HBc为IgG，这种IgG经常和HBcAg以复合物的形式存在于细胞核内，少数也见于胞浆及胞膜上。并证实，IgG只见于含有HBcAg的胞核内，而无核内HBcAg，就无抗-HBc存在。因此，如果能测出IgG（抗-HBc)，也就间接地证实了HBcAg的存在。IgG(抗-HBc)阳性呈圆形或卵圆形位于核内或以包涵体位于胞浆内。IgG阳性细胞的分布状态和HBcAg的分布相同。IgG(抗-HBc)在肝癌发病中起何作用，目前尚不清楚，有人认为IgG和HBcAg形成免疫复合的，由于免疫反应，在慢性活动性肝炎发病中和肝硬变形成中起重要作用，而慢活肝和肝硬变又是肝癌发生的重要环节 。HBcAg和抗-HBc形成的免疫复合物是否为癌变的始动因素，还有待进一步研究。
4．肝癌及癌周肝组织内HBxAg的定位及分布近年来，对HBV分子生物学研究发现了HBV另一种抗原，即HBxAg。HBxAg和肝癌发生的关系密切，已引起人们广泛的重视。目前，国内外已有少数文献报道关于HBxAg和肝癌发病的关系的研究。在人原发性肝癌组织内HBxAg的检出率大约为60%～80%，这明显高于HBsAg的检出率。在癌周肝组织内HBxAg阳性检出率在70%～80%，这和HBsAg的检出率基本相似。用PAP或ABC方法检测HBxAg，其阳性物质呈棕褐色均匀细颗粒状，主要位于癌细胞和肝细胞胞浆内，部分病例除胞浆阳性外，胞膜或核亦阳性（约20%)，单独膜型或核型少见。不同病例HBxAg阳性物质的分布及阳性反应强度是不同的，就是同一病例不同部位，其结果也不尽相同。一般来说，癌周肝组织内HBxAg阳性检出率及阳性反应强度比癌组织内高。其反应强弱与HBxAg含量多少有关。HBxAg阳性细胞分布与HBsAg阳性细胞分布相似，亦分为散在型，局灶型和弥漫型。在癌周硬变组织内，HBxAg阳性细胞有时围绕小血管分布。有的则沿着纤维膈分布。在HBxAg阳性病例，有24%在癌组织内伴有HBsAg和/或HBcAg，有72%在癌周肝组织内伴有HBsAg和/或HBcAg。HBx－Ag在肝癌发病中的作用，目前尚不完全清楚。有人报道在肝癌患者血清中含有较高的抗-HBx，其检出率高达85%。Miyaki等（1986)发现在所检查的原发性肝细胞癌组织中都存在和HBV的X基因相同的DNA序列。有些作者认为，宿主细胞DNA和HBv DNA的整合是通过X基因区特殊的重组来完成的，其翻译产物-HBx蛋白（HBxAg)对癌基因具有反式激活作用，而引起细胞癌变。最近有人通过HBV的X基因在转基因小鼠中诱发肝癌的动物实验证明，HBx蛋白能够改变宿主基因的表达，并导致肝细胞癌的发生。因此，有些作者认为HBxAg在肝癌发生中具有重要作用，并认为HBV可能具有直接致癌作用。
