五、在IGSS染色中常见技术问题和对策
（一)背景染色产生的原因和防止方法
（1)第一抗体或金标抗体稀释度不合适，一般容易犯抗体使用过浓的毛病，认为抗体越浓越好，结果适得其反。应该先作方阵滴定，优选最佳稀释倍数（见第一章 )，即可避免非特异性染色，又可节 省抗体。
（2)使用正常箅清封闭和在抗体稀释液中加入牛血清白蛋白，可以减少非特异吸附，降低背景染色。
（3)显色的器皿必须彻底清洗，化学试剂必需用三蒸馏水配制。
（4)乳酸银和硝酸银的显色在避光的环境中反应。醋酸银则可在有光的环境中显色。
（5)显色时切片应垂直放置在银显影液中，使过多的银颗粒下沉，如水平放置易沉淀于切片上。
（6)控制反应时间，显影液加入适量的阿拉伯胶或明胶可以延缓反应速度，避免形成过多的还原银，非特异地吸附在切片上。一般加入明胶1%～2%，效果比较满意，反应时间根据室温而定，室温25℃左右显色时间10～15min，室温在20℃以下，显色时间20～30min左右。
（7)洗涤：使用TBS时最好加入0.05%～0.1%的Triton X-100或Tween 80，可以洗脱掉组织表面发生非特异性吸附的污染蛋白，防止出现背景的非特异染色。
（二)背景染色已发生应如何消除
（1)2%硫代硫酸钠，1%铁氰化钾等量混合，加在切片上至背景无色为止。
（2)2%铁氰化钾和1%溴化钾等量混合作用1min水冲洗，然后加上2%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠脱色，至背景干净为止。
（3)0.1%重铬酸钾加0.25%浓硫酸，在显微镜下控制脱色时间，至阳性结果清楚，无背景为止。然后用5%硫代硫酸钠漂白。注意时间不要过长，以免阳性结果被脱掉。
（4)用0.3%～1%的H2O2 处理切片也可消除背景的银颗粒。但必须在显微镜下控制脱水时间，防止把阳性结果脱色。
（三)彩色显影背景过染的处理方法
彩色免疫金银法，在胶体金技术中是一个很大的突破，它的优点是结果鲜明，对比度好，但是在彩色显影过程中时间过长，背景可有一些着色，彩色显影的时间控制很重要。一旦过染可用以下方法处理。
（1)纯酒精滴到切片上3～5s,立即冲掉，水洗，充分地把酒精洗掉，如果洗不彻底，造成阳性结果脱色。
（2)75%的酒精滴到切片上1min，立即冲掉，脱色不能时间过长，过长后阳性结果全部脱掉。
六、物理显影液及缓冲液的配制
（一)缓冲液的配制
（1)0.05mol/l pH7.4 TBS 配制
Tris（三羟甲基胺基甲烷)12.1g
NaCl 17.5g
加双蒸水 1900ml
然后用浓HCL调至pH为7.4再加双蒸水至2000ml
Tris 4.84g
NaCl 17.5g
BSA 2.0g
NaN3 1.0g
双蒸水1900ml,充分搅拌至溶质完全溶解,用浓HCl调pH至8.2,再加双蒸水至2000ml。
（二)银显影液的配制
1．乳酸银显影液的配制：混合以下溶液
①10%阿拉伯胶水溶液60ml
②枸橼酸缓冲液pH 3.5 10ml
③对苯二酚1g,加双蒸水20ml溶解。
④乳酸银水溶液100 mg加水10ml。
注意在暗处显影。
2．硝酸银显影液的配制
①10%阿拉伯胶水溶液60ml。枸橼酸缓冲液ph 3.5 10ml
②对苯二酸1.7g水溶液30ml。
③硝酸银40mg水溶液2ml。
①②两溶液完全溶解，临用前加入硝酸银溶液。在暗处显影。
4．彩色显影液的配制
①0.2N氢氧化钠的异丙醇溶液5ml溶入100mgα-萘酚（或菲尼酮)。
②500mg碳酸钠，25mg溴化钾，50mg亚硫酸钠，加双蒸水25ml。
①②两液1：10混合，室温下彩色显影。
5．醋酸银显影液
①15%阿拉伯胶60ml，柠檬酸缓冲液10ml，pH3.5。
②对苯二酚1.7g溶于20ml蒸馏水中。
③醋酸银100mg溶于蒸馏水10ml中。
用前①②③依次混合，不需要避光，在室温下显影。
（三)柠檬酸缓冲液的配制
柠檬酸（C6H8O7.H2O)25.5g
柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O)23.5g
加重蒸水100ml溶解即成，pH3.5
(四)氢氧化钠（NaOH)无水乙醇饱和溶液的配制
8g氢氧化钠，加入100ml无水乙醇振摇溶解即成。
