（2)颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周后

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周后

　　加强免疫（融合前三天)1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

　　取脾融合

　　（二)细胞融合

　　1．细胞融合前准备

　　（1)骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。

表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

　　骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

　　（2)饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节　需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。

　　2．细胞融合的步骤

　　（1)制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。

　　与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周龄

　　↓

　　拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min

　　↓

　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　↓

　　用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管)

　　↓

　　反复冲洗，吸出冲洗液

　　↓

　　冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS)或胎牛血清（FCS)的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培养

　　（2)制备免疫脾细胞

　　最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死

　　↓

　　无菌取脾脏，培养液洗 一次

　　↓

　　脾脏研碎，过不锈钢筛网

　　↓

　　离心，细胞用培养液洗2次

　　↓

　　计数

　　↓

　　取108脾淋巴细胞悬液备用

　　（3)制备骨髓瘤细胞

　　取对数生长骨髓瘤细胞离心

　　↓

　　用无血清培养液洗2次

　　↓

　　计数，取得×107细胞备用

　　（4)融合

　　①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

　　②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000)溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。

　　③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　　④离心，800rpm, 6min。

　　⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。

　　⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

　　⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

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