（二)试剂盒成份
1．无标记对照DNA1 此管内有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分别用BamHⅠ,BglⅠt HinfⅠ消化，它们的混合比例为2：3：3，共有16个Pbr328片段，这些片段的大小分别为：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220和154×2bp。
2．无标记对照DNA2 此管内有20μl pBR328 DNA200μg/ml，已用EcoRⅠ线性化。
3．DNA稀释缓冲液 有两管，每管1ml[成分为：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精DNA（50μg/ml)。
4．标记对照DNA 此管内有50μl线性化pBR328DNA，按标记方法已标记有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA，每毫升含5μg合成的标记DNA。
5．六聚核苷酸混合物
6．标记用混合底物 此管内有50μl 10倍浓度的dNTP标记用混合底物，含dATP（1mmol/L)dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。
7．DNA聚合酶Ⅰ大片段（标记级) 此管内有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow)，2U/μl。
8．（Dig)AP结合物 此管内有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，结合有碱性磷酸酶750U/ml。
9．NBT 有两管，每管1.25ml，是溶于70%（V/V)二甲基甲酰胺的硝基蓝四唑盐溶液（75mg/ml)。
10．X-磷酸盐 有两管，每管0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐的甲苯胺溶液（50mg/ml)。
11．封阻试剂 有两瓶，每瓶有50g粉剂。
（三)需配制的溶液
EDTA（0.2mol/L),pH8.0 (20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED－TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸钠盐；10%（V/V)SDS；20×SSC：3mol/l NaCl;0.3mol/L柠檬酸三钠；pH7.0 Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris –HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。
（四)操作方法
1．标记DNA探针 每次标准的反应可标记10ng至3μg线性的DNA，也可标记更大量的DNA，但所有的成分和体积要相应增加。
（1)DNA探针热变性，煮沸10min，迅速冷却于冰/乙醇中5min以上，待用。
（2)取Eppendorf管（1.5ml)置于冰上，加下列及试剂：
新鲜变性的DNA 1-3μg
六聚核苷酸混合物 2μl（管5)
dNTP标记用混合底物 2μl（管6)
加无菌重蒸水至 19μl
DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow) 1μl（管7)
（3)在37℃保温至少60min，可到20h。
（4)煮沸5min，终止反应。
（5)15000rpm离心30s，置于冰上待用。
2．预杂交 按100cm2膜用20～40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。
预杂交液组成：5×SSC
0.5%（W/V)封阻试剂（管11)
0.1%（W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠
0.02%（W/V)SDS
膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在65℃预杂交过夜。
3．杂交 按100cm2膜用2.5ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面的溶液重新分配。
杂交液组成： 50%甲酰胺（V/V)
5%（W/V)封阻试剂
5×SSC
0.1（W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠
0．02%(W/V)SDS
新变性标记DNA（150ng/ml)
杂交液取代预杂交液，替换间膜不能干，成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜（16～20h)。
4．洗膜 按100cm2膜用250ml洗膜液计算。
（1)在室温下用2×SSC/0.1%（W/V)SDS溶液漂洗，5min，2次。
（2)在65℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。
（3)在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。
5．免疫测定
（1)配制溶液
缓冲液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)
缓冲液2：0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50～70℃,此溶液保持混浊)。
缓冲液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。
缓冲液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)
显色溶液：新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45μlNBT溶液（管9)和35μlX-磷酸盐缓冲液（管10)。
2． 显色过程
A．膜在缓冲液1中短暂洗涤（1min)。
B．在100ml缓冲2中保温30min。
C．再用缓冲液1短暂洗涤。
D.用缓冲液1稀释的抗体结合物(管8)至150U/L(1:5000);稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。
E.膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。
F.用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合的抗体结合物,15min,2次。
G.膜在缓冲液3中平衡2min。
H.在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内,几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。当颜色显影时，不可振荡或搅拌。
I．当要求的点或带已被检测时，可用50ml缓冲液4洗膜5min终止反应。
J．摄相。
说明：上述各反应均在室温下进行，除了显色反应外，均需振荡或搅拌。
