（五)排除实验中问题的方法
1．DNA不能有效地被标记时考虑
（1)用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新纯化DNA。
（2)标记反应的保温时间延长（增至20h)。
（3)DNA变性或许不完全，这时对大片段DNA特别重要。
2．不能达到预期的灵敏度时考虑
（1)DNA标记率。
（2)增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。
（3)显色反应的时间可延长至3d。
3．若显色时背景过深，可采取
（1)在杂交溶液中减少标记DNA量。
（2)增加杂交溶液的体积，使膜随意漂浮在溶液中。
（3)某些类型的尼龙膜可能产生深色背景，因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。
（4)在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。
四、核酸的分子杂交
核酸分子的固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上，然后与溶液中的标记探针进行杂交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维膜。这里重点介绍直接点样技术，转移技术及其它常用的杂交技术。
（一)斑点杂交的直接点样法
斑点杂交或叫打点杂交（dot-blot hybridization)，其主要特点是事先不用限制内切酶消化或用凝胶电泳分离核酸样品，操作简便，灵敏度高。一个点样品只含0.25～1pg的DNA也能检测到。但不知道杂交片段的大小（碱基对数)。
1．DNA的打点法（DNa Dot Blot)
（1)膜的处理：戴上干净手套，取出硝酸纤维膜，按需要剪成一定大小，量好各样点间距离，用软铅笔标记。
（2)DNA变性：将DNA溶液于1×TE（pH8.0)缓冲液中或蒸馏水中，取一定量DNA样品加于小塑料管中，在100℃沸水中煮10min，迅速入冰水中。
（3)点样：用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1～5μl变性DNA，将滴管放在硝酸纤维膜上，使DNA慢慢吸在滤膜上，点样完后凉干。
（4)固定：将凉干的滤膜夹在滤纸中，于80℃干烤2～3h，然后进行杂交。
2．RNA的打点法（RNa Dot Blot)
（1)膜的处理：同DNA的打点法。
（2)RNA变性：将提取的RNA与50μl 20×SSC/甲醛（30μl 20×SSC加20μl甲醛)混合，65℃水浴15min。
（3)点样：同DNA的打点法。
（4)固定：同DNA的打点法。
（二)DNA的吸印转移法（Southern Blot)
DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后，放入碱性溶液中使其变性，将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上，然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置，而且能测定分子量。
试剂：变性液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl
中和液：1mol/l Tris-HCl, 1.5mol/L NaCl pH8.0
20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠，3mol/l NaCl
1．电泳 取DNA约5μg加限制性内切酶进行酶切，电泳鉴定酶切完全后，取酶消化后的DNA点样于0.8%～1.2%的凝胶上，以0.8～1V/cm电压电泳过夜，在溴酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后的凝胶翻转，紫外灯照射10～20min后拍照。
2．变性与中和 将电泳后的凝胶放入变性液中25℃振荡60min。蒸馏水洗胶1min，将凝胶放入中和液中25℃振荡60min。
3．转移 取托盘一只，放入10×SSC溶液约500～1000ml，托盘上搭一块比凝胶稍宽的长方形玻璃，取一长方形Wateman paper（滤纸)搭在桥上，两边浸入10×SSC溶液中，仔细去掉玻璃与滤纸之间的气泡（用玻棒在滤纸上滚动)。将凝胶放在滤纸上，去掉凝胶与滤纸之间的气泡。将硝酸纤维膜放入2×SSC溶液中浸湿后放在凝胶上（如NC膜浸湿不均匀，则考虑更换NC膜，操作时手切勿触及NC膜)，去掉凝胶与NC膜之间的气泡。将一张滤纸（长和宽均比NC膜小1mm)放在NC膜上，仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小，重叠放在滤纸上，再压一重物约500～1000g。转膜24h，中间更换吸水纸。
图23-7 Southern转膜示意图
4．固定 用2×SSC溶液洗膜5min去掉残余凝胶，让膜自然凉干。将凝胶放入EB液中30min，取出在UV灯下观察是否有DNA残余。80℃烤膜2h，然后将膜封入塑料袋进行杂交。
