第八章　色谱分析法概论

第一节  概述

色谱法（chromatography)是一种对混合物进行分离分析的方法。由于色谱法具有很强的分离能力，加上现代色谱检测器具有很高的灵敏度，色谱法已成为分离分析复杂混合物的最重要手段，广泛应用于医药卫生、食品、环境、材料、化工、农业及生命科学等各个领域。本章在介绍色谱法基本概念和方法的基础上，重点介绍经典液相色谱法

一、色谱法的发展

色谱法创始于20www.med126.com/sanji/世纪初，1906年，俄国植物学家Tswett在研究植物色素时，将植物色素的石油醚提取液通过装有碳酸钙的玻璃管，再用石油醚淋洗，发现在柱管上形成了不同颜色的色带。管内填充物称为固定相（stationaryphase)，淋洗剂称为流动相（mobile phase)，而填充有固定相的管柱被称为色谱柱（column)。分段收集从管柱中洗脱出的各色带的洗脱液，便可分离得到石油醚提取液中的叶绿素、叶黄素、胡萝卜素等各种色素。Tswett把这种分离方法称为色谱法。后来，这种方法也用来分离无色物质，但色谱一词仍沿用至今。也有人称之为层析法。

自从Tswett建立以吸附剂为固定相的吸附柱色谱法以来，色谱法至今已有一个世纪的历史。在这期间，先是经历了经典液相色谱法的发展过程。1935年出现了用离子交换剂作固定相的离子交换柱色谱法，在1941年Martin及Synge发明了以液体为固定相的分配柱色谱法， 1944年Martin等人用滤纸作分配色谱的载体，建立了纸色谱法，1956年出现了薄层色谱法，1959年又出现了凝胶柱色谱法。在二十世纪五十年代后，现代色谱法逐步建立和发展起来。1952年Martin等人以气体作流动相，建立了气相色谱法，这一年，Martin因其在色谱领域所做出的杰出贡献获得诺贝尔化学奖。1968年前后产生了高效液相色谱法。在二十世纪六十至八十年代，产生了超临界流体色谱法和毛细管柱色谱法。在各种类型色谱方法建立的同时，色谱理论也趋于成熟，Martin和Synge在建立分配色谱法的同时，提出了表达柱效能模式的塔板理论；在气相色谱法兴起后， Van Deemter等人又提出了速率理论，结合气相色谱法的色谱过程，分析和总结了影响柱效能的因素。速率理论为气相色谱法的实践提供了理论指导，同时，也为高效液相色谱法的创建提供了启迪和依据。

二、色谱法的分类

色谱法种类很多，可从不同的角度对其进行分类。

1. 按流动相和固定相的物理状态分类　在色谱法中，流动相可以采用气体、液体或超临界流体。根据流动相的物理状态，可分为气相色谱法（gas chromatography,GC)、液相色谱法（liquidchromatography, LC)和超临界流体色谱法（supercriticalfluid chromatography, SFC)。在气相色谱法中，固定相为固体吸附剂的称为气固色谱法，固定相为液体（涂布在担体表面或毛细管壁)的称为气液色谱法；在液相色谱法中，固定相为固体吸附剂的称为液固色谱法，固定相为液体（涂布在担体表面)的称为液液色谱法。此外，将采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱法（bondedphase chromatography, BPC)。

2. 按操作形式分类　固定相装在管柱内的色谱法称为柱色谱法（column chromatography)。按照管柱的粗细和固定相的填充方式又分为填充柱色谱法（packedcolumn chromatography)和毛细管柱色谱法（capillarycolumn chromatography)。

固定相呈平面状的色谱法称为平面色谱法（planar chromatography)。按平面色谱材料不同，又可分为薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC)和纸色谱法（paper chromatography)。

3. 按色谱过程的分离机理分类

（1)吸附色谱法（adsorption chromatography)：根据不同组分在吸附剂（固定相)上吸附能力不同而进行分离的色谱方法。如气固色谱法、液固色谱法。

（2)分配色谱法（partitionchromatography)：根据不同组分在固定相（液体)和流动相之间分配系数的不同而进行分离的色谱方法。如气液色谱法、液液色谱法。

（3)离子交换色谱法（ion exchange chromatography)：根据不同组分离子对离子交换剂（固定相)的亲和力不同而进行分离的色谱方法。

（4)尺寸排阻色谱法（sizeexclusion chromatography)：又称凝胶色谱法（gel chromatography)，根据不同大小的组分分子在多孔性凝胶（固定相)中的选择性渗透而进行分离的色谱方法。

（5)亲和色谱法（affinitychromatography)：根据不同组分与固定化分子（固定相)的高专属性亲和力进行分离的色谱方法。在此基础上，又发展产生了生物色谱法（biochromatography)。生物色谱法采用各种具有生物活性的材料（例如：酶、载体蛋白、细胞膜、活细胞等)作固定相，是利用固定相与各种生物活性物质的选择性结合而进行分离的色谱方法。

三、色谱法的基本原理

（一)色谱分离过程

在色谱分离过程中，当流动相携带试样对固定相作相对运动时，由于试样中各组分在固定相和流动相之间的作用力（如吸附力、溶解力、离子交换力、分子排阻力和亲和力等)有微小差别，使得不同组分被流动相运载移动的速率不同，产生差速迁移（differential migration)，从而使性质有微小差异的不同组分被分离。差速迁移是色谱分离的基础。

以吸附柱色谱法为例，如图8-1所示。

图8-1色谱分离过程示意图

当试样加到装有吸附剂颗粒的色谱柱顶端，试样中各种组分便被固定相吸附，再向色谱柱中不断加入流动相（洗脱剂)，当流动相通过固定相颗粒空隙时，已被吸附在固定相的试样组分又溶于流动相中而被解吸，并随着流动相向前移行，已解吸的试样组分遇到新的固定相颗粒，又再次被吸附。如此，在色谱柱上发生反复多次的吸附-解吸或分配过程。由于各种组分的化学结构和性质不同，固定相对它们的吸附力大小不同，在色谱柱上的保留作用也就不同。与固定相作用力较弱的组分在色谱柱上的保留作用较小，在色谱柱中迁移速率较快，先流出色谱柱；与吸附剂作用力较强的组分在色谱柱上的保留作用较大，在色谱柱中迁移速率较慢，后流出色谱柱。于是，试样中的各个组分便被色谱柱分离。

由色谱分离过程可知，色谱法是利用混合物中各组分在两相（固定相与流动相)中吸附、分配、离子交换、亲和力、分子尺寸等的差异，使固定相对各组分保留作用不同，产生差速迁移而进行分离分析的方法。

第二节  经典液相柱色谱法

经典液相色谱法，包括各种柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法等，具有样品容量大、所需设备简单、操作方便、成本低等特点，所以适用于试样的分离和提纯，也可作初步的定性和定量分析。

一、吸附柱色谱法

吸附柱色谱法以固体吸附剂为固定相，所以又称液固色谱法。吸附柱色谱法是最早建立的液相色谱法。

（一)吸附柱色谱法的基本原理

1.吸附作用和吸附平衡

吸附柱色谱法的固定相是吸附剂。吸附剂通常是具有较大比表面积的多孔性固体颗粒物质，在它的表面存在着许多分散的吸附点位。当试样中的组分分子（X)被流动相带入色谱柱后，在固定相表面的吸附点位上将发生组分分子（X)与吸附在固定相上的流动相分子（M)的竞争吸附，直到组分分子被吸附到固定相上的速度与其从固定相上解吸下来的速度相等时，达到吸附平衡。

吸附平衡及吸附平衡常数K_ad可表示如下：

    （8－1)

式中，、分别为组分分子和流动相分子在固定相表面的平衡浓度；、分别为组分分子和流动相分子在流动相中的平衡浓度。吸附平衡常数K_ad是评价色谱柱对某个试样组分保留能力的一个参数。

若某组分的K_ad值较大，表明该组分在两相中达到吸附平衡时，该组分在固定相中的保留作用较强，难以洗脱；若某组分的K_ad值较小，则表明该组分在两相中达到吸附平衡时，该组分在固定相中的保留作用较弱，易于洗脱。不同组分，由于其K_ad值不同，所以在色谱过程中彼此分离。

2.   吸附等温线

在一定温度下，组分在吸附剂表面被吸附达到平衡时，组分在两相中浓度相对关系的曲线，称为吸附等温线（adsorption isotherm)。它用于描述组分在吸附剂上的吸附规律。吸附等温线的横坐标为组分在流动相中的浓度，纵坐标为被吸附在固定相表面的组分的浓度。

吸附等温线通常有直线型、凸线型和凹线型三种（见图8－2)。

图8－2  三种吸附等温线

（1)直线型等温线：这是理想的吸附等温线。直线斜率是一恒定常数，相当于某组分在两相中的吸附平衡常数K_ad恒定。吸附色谱出现直线型等温线的情况较少。

（2)凸线型等温线：在吸附色谱法中，当组分浓度较高时，容易出现凸线型等温线。凸线型等温线形成原因是：吸附剂表面常有多种吸附力不同的吸附点位，组分分子总是先占据吸附力强的点位，然后再占据吸附力弱的点位。这样，在组分浓度较低时，被吸附剂吸附得较牢固，较难洗脱；而在组分浓度较高时，在固定相上吸附较松弛，易洗脱。

（3)凹线型等温线： 吸附色谱出现凹线型等温线的情况较少。当组分浓度较高时，有时会在吸附过程中发生另外的一些反应，例如，已被吸附剂吸附的组分分子会通过氢键作用而吸附更多的组分分子，使得吸附剂对组分的吸附力增强。这样，在组分浓度较高时，吸附较强，较难洗脱。

其实，在凸线型或凹线型等温线中，当试样组分在流动相中的浓度较低时，即在等温线的起始部分，曲线近似为直线。也就是说，吸附等温线仅在较低的浓度范围内呈线性。

（二)固定相和流动相

  1. 固定相

对吸附剂的基本要求是：吸附剂的粒度均匀、大小适当，有一定机械强度；具有较大的比表面积，吸附点位的吸附能力大小均匀；不与流动相以及被测组分发生化学反应，也不溶于流动相。

常用的吸附剂可分为极性和非极性两大类。极性吸附剂包括各种无机氧化物，如硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁及分子筛等；非极性吸附剂最常见的是活性炭。

（1)硅胶（SiO₂·xH₂O)：硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，是柱色谱法和薄层色谱法最常用的吸附剂。硅胶为多孔性硅氧烷交联结构，表面具有硅羟基活性基团，可与极性化合物或不饱和有机化合物形成氢键而具有吸附性。硅羟基也能与水形成氢键结合，生成水合硅羟基。由于硅羟基已与水之间形成氢键，不再具有吸附其它物质的能力，使硅胶的吸附能力降低，或失去吸附活性（称为失活)。当加热到100 ℃左右时，硅胶表面吸附的水（称为“自由水”)能被可逆地除去，使硅胶的吸附能力恢复。硅胶加热去水的过程称为活化（activation)。硅胶的活化温度要适宜，一般为110 ℃左右，加热30 min。如果活化温度太高，当超过500 ℃时，会使硅羟基失去一个水分子（称为“结构水”)，不可逆地变成硅氧烷结构，反而使硅胶失去吸附活性。

（2)氧化铝：是一种吸附能力较强的吸附剂。供柱色谱法使用的氧化铝有酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝适用于酸性色素、羧酸、氨基酸等酸性化合物和对酸稳定的中性化合物的分离。碱性氧化铝适用于生物碱、胺类等碱性化合物和一些中性化合物的分离。中性氧化铝适用于烃、生物碱、萜类、甾族、甙类、酯、内酯、醛、酮、醌等类化合物的分离，凡是酸性或碱性氧化铝可以分离的化合物，都能用中性氧化铝分离。

氧化铝的吸附能力也与其含水量有很大关系。含水量越高，吸附能力越小，即活性越低。所以，氧化铝也可以通过加热除水进行活化。通常可将氧化铝置于约400 ℃的电炉内，恒温加热6 h，取出后，放入密闭的干燥器备用。使用时可根据所需活性大小适量加水。

氧化铝及硅胶的活性都与含水量有关，活性的强弱用活度级别表示，活度级别的数值越小，其活性越强，吸附剂的含水量越低。硅胶、氧化铝的含水量与活性关系见表 8－1。

表8－1  硅胶、氧化铝的含水量与活性关系

吸附剂选择的基本原则是：分离弱极性物质，一般选用活性较强的吸附剂；分离强极性物质，应选用活性较弱的吸附剂。

2．流动相

（1)对流动相的基本要求： 纯度合格，否则，所含杂质会干扰试样组分的分离；能溶解试样，但不与试样以及吸附剂发生化学反应；粘度小，能保持一定的洗脱速率；性质稳定，有一定的挥发性，对分离组分的回收没有干扰。

（2)流动相的选择： 流动相的洗脱能力主要由其极性决定。由于在吸附色谱过程中，流动相分子与试样组分分子竞争吸附剂表面的吸附点位，强极性的流动相分子占据吸附点位的能力强，其洗脱能力强，使试样组分的K_ad值小，保留时间短。溶剂洗脱能力可用Snyder提出的溶剂强度e⁰表示，e⁰为溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能。通常，溶剂的e⁰越大，则溶剂的极性越大，固定相对溶剂的吸附作用力也就越大，溶剂的洗脱能力也就越强。表8－2列出一些溶剂在氧化铝上的e⁰值。

表8－2 一些溶剂在氧化铝上的e⁰值

由于各种溶剂的e⁰值间隔较大，对于多组分复杂混合物的分离，难以用一种溶剂实现。为了得到适当溶剂强度的流动相，可用两种以上的溶剂，按一定的比例组成混合流动相，通过改变流动相的性质和组成来实现较好的分离。

通常可以根据“相似相溶”的原则选择流动相。对极性大的试样采用极性较强的流动相；对极性小的试样则采用极性较弱的流动相。

吸附柱色谱法对于不同族化合物的分离能力较强，对同分异构体的分离效果也较好，但对同系物分离的选择性较差。一般不适宜分离强极性化合物。

二、分配柱色谱法 

在分配柱色谱法中，固定相和流动相均为液体，故又称为液液色谱法。根据固定相和流动相极性的不同，可分为正相色谱法和反相色谱法。当固定相的极性强于流动相的极性时，称为正相色谱法，反之称为反相色谱法。分配柱色谱法与吸附柱色谱法相比，具有适用范围广的优点。

（一)分离原理

分配柱色谱法的分离原理是根据被分离的各个组分在互不相溶的固定相和流动相中溶解度不同，即不同组分在两相中达到分配平衡时具有不同的分配系数来实现的。在试样组分随流动相移动通过色谱柱的过程中，组分在两相中不断建立、打破和重新建立分配平衡。各组分由于具有不同的分配系数，它们在柱中发生了许多次的分配平衡后，就产生了差速迁移，从而得到分离。

（二)固定相和流动相

1. 固定相

分配柱色谱法的固定相就是涂布在惰性载体表面上的固定液。要求所选用的固定液对待分离组分是一种良好的溶剂，而不溶或很难溶于流动相。在分配色谱法中，常用的固定液有甲醇、甲酰胺、聚乙二醇、辛烷、硅油和角鲨烷等。

固定液的载体又称担体，载体起负载固定液的作用，要求载体是惰性、多孔、有较大表面积的固体颗粒。常用的载体有硅胶、纤维素、多孔硅藻土等。

2. 流动相在分配色谱法中，由于流动相也参与被分离组分的分配作用，流动相极性的微小变化都会使组分的保留值出现较大的改变，因此，经常通过选择适当的流动相来达到预期的分离效果。

在分配柱色谱法中，要求流动相纯度高、粘度小、尽可能不与固定相互溶，即流动相与固定液之间极性差别越大越好。此外，为防止固定液的流失，流动相在使用前，须预先使流动相中溶解的固定液达到饱和。

在分配柱色谱法中，对于被分离组分，固定液是一种溶解度较大的溶剂，而流动相是一种溶解度较小的溶剂。这样可使固定相对各组分有较好的保留，从而固定相对各组分保留的差异也就比较大，因此，各组分能获得良好的分离。根据这个原则，针对不同极性的被分离物质，可选用不同类型的分配柱色谱法。

三、离子交换色谱法

离子交换色谱法是利用被分离组分离子在固定相上亲和性的差异而进行分离的液相色谱方法。离子交换色谱法适用于离子型化合物的分离，在无机化学、生物化学和医药卫生等领域中都有广泛的应用。

（一)离子交换色谱法原理

在离子交换色谱法中，常用离子交换树脂作固定相。离子交换树脂为具有网状结构的高分子聚合物（骨架部分)，并带有活性基团。活性基团由两部分组成，一部分为带负电荷的阴离子基团或带正电荷的阳离子基团，如磺酸基（－SO₃^－)或季胺基（－N^＋（CH₃)₃)等，为不可交换的离子基团；另一部分为这些离子基团上结合的与其电性相反的离子，如 H^＋或OH^-等，为可交换离子。根据可交换离子的电荷极性不同，离子交换树脂分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，相应的色谱方法分别称为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。在离子交换色谱法的分离过程中，被分离物质在流动相中电离产生的组分离子，与固定相上的可交换离子进行可逆交换。由于试样中各种被测离子与离子交换树脂的相互作用（或称亲和力)不同，与离子交换树脂亲和力强的被测离子在固定相中保留时间较长，而与离子交换树脂亲和力弱的被测离子在固定相中保留时间较短，这样，试样的各组分在反复进行的离子交换色谱过程中产生差速迁移，因而得到分离。

（二)固定相和流动相

  1.固定相

离子交换色谱法的固定相称为离子交换剂，通常使用合成的离子交换树脂和离子交换纤维素作固定相。

（1) 离子交换剂种类  按活性基团的不同，离子交换剂可分为四种：

1)强酸性阳离子交换剂（活性基团为—SO₃H)；

2)弱酸性阳离子交换剂（活性基团为—COOH)；

3)强碱性阴离子交换剂（活性基团为—N⁺R₃X^-)；

4)弱碱性阴离子交换剂（活性基团为—NH₂，—NHR或—NR₂)。

（2)离子交换树脂的指标

1)交联度（degree of cross linking )：离子交换树脂中交联剂的含量称为交联度，以质量百分比表示，不同品种树脂的交联度范围为1%~16%。如应用最广泛的聚苯乙烯型合成树脂，它是以二乙烯苯作为交联剂，将聚乙烯直链交联起来而形成的网状结构的聚合物。交联度与树脂的网状结构上的网孔大小有关：若交联度大，表明树脂网状结构紧密，网孔小，大离子不易进入树脂内部，离子交换速度慢，选择性好，适用于分子量较小的离子性物质分离；若交联度小，则树脂网孔大，交换速度快，选择性差，适用于分子量较大的离子性物质分离。

2)交换容量（exchange capacity)：每克干树脂能参加交换反应的活性基团数称为交换容量，单位为mmol/g或mmol/ml，交换容量反映树脂交换反应的能力。

3)粒度：用树脂溶胀后能通过的筛孔目数表示离子交换树脂粒度的大小。制备纯水用的离子交换树脂粒度一般为10～50目，色谱分析用的离子交换树脂粒度一般为100～200目。

2. 流动相

离子交换色谱法的流动相通常为缓冲溶液。可通过调节流动相的pH值或离子强度，调整试样组分的保留值。流动相pH值的变化，能导致离子型化合物在溶液中电离程度发生变化。如果电离度增大，则试样组分以离子形式存在的比例增大，试样组分的保留值也增大。如果增加流动相中其它盐离子浓度，即增大流动相的离子强度，则削弱了试样组分离子的竞争交换能力，使试样组分离子的保留值降低。此外，如果在流动相中加入甲醇或乙醇等有机溶剂，也可调节试样组分的保留值。

四、尺寸排阻色谱法

尺寸排阻色谱法(sizeexclusion chromatography )又称凝胶色谱法(gel chromatography)，或空间排阻色谱法等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离试样中各组分的液相色谱法。对于水溶性试样采用水溶液为流动相，称为凝胶过滤色谱法(gel filtration chromatography)；对于非水溶性试样采用有机溶剂为流动相，称为凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography)。尺寸排阻色谱法主要应用于分离高分子化合物，常用于分离提纯生物高分子（如蛋白质、核酸、多糖等)化合物，除去其溶液中低分子量杂质。

（一)分离原理

尺寸排阻色谱法是依据被分离组分分子的尺寸和形状不同来实现分离的。尺寸排阻色谱法的固定相为化学惰性、具有多孔网状结构的凝胶，凝胶内具有一定大小的孔穴。根据被分离试样组分分子的大小，选用具有相应孔穴大小的凝胶作固定相。当试样组分进入色谱柱时，体积大于凝胶孔穴的试样组分分子不能渗透到孔穴中，因此不被固定相保留，较早地随流动相流出色谱柱；体积小于凝胶孔穴的试样组分分子可渗透进入凝胶孔穴，这些组分分子依据其分子的不同大小分别渗入到凝胶孔穴的不同深度，并被固定相程度不同地保留，其中体积较大的组分分子在色谱柱中保留时间较短，而体积较小的组分分子在色谱柱中保留时间较长，从而使试样组分分子按其分子大小先后从柱中流出，得以分离。

（二)固定相和流动相

尺寸排阻色谱法固定相种类很多，葡聚糖凝胶是最常用的固定相，商品名为Sephadex，它由葡聚糖经稀盐酸降解后，用环氧丙烷交联制成。葡聚糖凝胶的交联度与其吸水量和机械强度有关。凝胶的交联度越小，其网状结构的孔隙就越大，所以吸水溶胀的程度就越大，其机械强度就越小。交联度可用每克干凝胶吸收水分的重量来表示，商品型号用含水量的十倍表示，如含水量为7.5 g/g的葡聚糖凝胶的商品名为Sephadex G75。根据凝胶的交联度或含水量可判别凝胶的机械强度。通常将吸水量>7.5 g/g的凝胶归属为软质凝胶（软胶)，如Sephadex G100、G150、G200等；而将吸水量<7.5 g/g的凝胶归属为刚性凝胶（硬胶)，如Sephadex G15、 G25、G50等。软质凝胶适用于水溶液体系，只能在较低的流速和柱压下使用，主要用于分离生物高分子，如酶、蛋白质、核酸以及多糖类。刚性凝胶适用于有机溶剂系统，适于在较高压力下使用，常用于从大分子物质中除去小分子杂质。除了葡聚糖凝胶以外，常用的凝胶还有琼脂糖凝胶、聚苯乙烯凝胶、聚丙烯酰胺凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等。

尺寸排阻色谱法的流动相必须能溶解试样，粘度低，与凝胶的浸润性好。当采用软质凝胶时，流动相必须能使凝胶溶胀。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、二氯乙烷、三氯甲烷、苯、二甲基酰胺和水等。 执业医师

第三节 平面色谱法

上一节中介绍的液相柱色谱法，其固定相是填充在管柱中的，固定相也可以涂铺或结合在平面载体上，这类液相色谱法被称为平面色谱法  (planar chromatography)。平面色谱法包括薄层色谱法和纸色谱法。

一、薄层色谱法

薄层色谱法是将被分离的试样溶液点在薄层板的一端，再用溶剂把试样展开，从而使试样组分分离。薄层色谱法根据所采用的固定相及其分离原理不同，可分为吸附、分配、离子交换及凝胶色谱等类型。其中采用吸附剂作固定相的吸附薄层色谱法应用最广泛。

（一)薄层色谱法的原理

现以吸附薄层色谱法为例说明薄层色谱法的原理，将一定粒度的吸附剂均匀地涂铺在表面光洁的玻璃或塑料平板上，制成薄层板。然后把待分析试样的溶液滴加在薄层板一端的起始线上（称为点样，样点称为原点)。再把点样后的薄层板放入密闭容器（称为层析缸)中，使薄层板的底端浸入适当的溶剂（流动相，称为展开剂)。展开剂在薄层的毛细管作用下，缓缓地在薄层上向前移动，当展开剂经过原点时，就带着试样组分一起向前移动（称为展开)。在展开过程中，组分在两相之间发生多次吸附-解吸平衡。由于吸附剂对不同组分的吸附能力不同，所以不同的组分向前移动的速率不同，展开一定时间后，不同组分互相分离，在薄层板上形成不同距离的斑点。各组分在薄层上的位置用比移值（retardation factor, retentionfactor, R_f)表示（见图8－3)。

（8－2)

式中，a为原点中心至斑点中心的距离；C为原点中心至溶剂前沿的距离。

图8-3  R_f值测量示意图

R_f值相差越大，则分离越好。一般要求分离后组分的R_f值在0.2～0.8之间，各组分的R_f值之差应大于0.05，以防斑点重叠。

影响R_f值的因素较多，在实际工作中，由于色谱操作条件较难完全一致，R_f值难以重复。为消除因色谱操作条件而引起的误差，有人提议采用相对比移值R_st定性，使定性结论更为可靠。R_st定义为：

     （8－3)

式中，a为原点中心至待测物质斑点中心的距离；b为原点中心至参考物质斑点中心的距离。

（二)固定相和流动相

   1．固定相

吸附薄层色谱法所用固定相与吸附柱色谱法相同，常用硅胶和氧化铝等吸附剂作固定相，有时根据需要也选用其它吸附剂，如聚酰胺、硅藻土、纤维素等。但吸附薄层色谱法中采用的吸附剂粒度要比吸附柱色谱法中所用的粒度更细，约为200目（10～40 mm)左右，所以吸附薄层色谱法的分离效率要比吸附柱色谱法高。

2. 流动相

薄层色谱法中采用单一溶剂或多元混合溶剂作流动相，称为展开剂（developingsolvent, developer)。与吸附柱色谱法中选择流动相的一般规则相同，展开剂的选用要从被分离试样组分极性、吸附剂活性和展开剂的极性三个因素综合考虑。对于极性较小的被分离试样组分，应选用活性较强的吸附剂，极性较小的展开剂；对于极性较大的被分离试样组分，应选用活性较弱的吸附剂，极性较大的展开剂。Stahl 设计了一个示意图来表示被分离试样组分极性、吸附剂活性和展开剂极性这三者之间的关系（见图8－4)。使用这个简图时，首先根据被分离试样组分极性，将三角形的一个角固定在相应的位置，这时，三角形的另两个角就指明了相应的吸附剂活性和展开剂极性。

图8－4  被分离试样组分极性、吸附剂活性和展开剂极性之间关系示意图

在展开时，通常先根据试样组分的极性，用单一溶剂展开，其优点是溶剂简单，分离重现性好。但对于难分离化合物，常常需要采用多元混合展开剂来调整展开剂的极性，以达到满意的分离效果。多元混合展开剂中的各种溶剂在展开过程中所起作用不同。占比例较大的溶剂为主要溶剂，可使试样组分溶解并基本分离；占比例较小的溶剂可进一步调整各组分R_f值，改善分离效果。例如，某试样用甲苯作展开剂进行展开时，如果R_f值太小，斑点在原点附近，则可加入一定量的极性相对较大的溶剂，如丙酮或乙醇等；反之，如果R_f值太大，斑点在溶剂前沿附近，则可加入一定量的极性相对较小的溶剂，如环己烷或石油醚等，并根据分离的效果调整多元混合展开剂中各溶剂的比例。此外，在分离酸性或碱性组分时，往往还在展开剂中加入少量酸或碱，以防这些组分离解，使这些组分的斑点更加集中和清晰，从而提高分离度。当展开剂的粘度太大时，可在展开剂中加入粘度小的溶剂，以降低展开剂粘度，从而提高展开速度。

（三)操作技术

1. 薄层板的类型、制备和活化

（1)类型：薄层板可分为不加粘合剂的软板和加粘合剂的硬板两种类型。软板无商品，须自制。硬板有商品，也可以自制。其尺寸可根据实验要求和层析缸的大小自由选择。常用的粘合剂有煅石膏(Gypsum，简称G)、羧甲基纤维素钠（CMC-Na)、淀粉和聚丙烯酸（为高效薄层板常用粘合剂)。依据吸附剂是否含粘合剂或荧光剂，薄层色谱法用的硅胶有硅胶G（含煅石膏作粘合剂)、硅胶H（不含粘合剂)，以及硅胶HF₂₅₄、硅胶GF₂₅₄等品种（F代表吸附剂中含荧光剂，在254 nm或366nm紫外光下可观察到荧光，所制备的薄层板适用于本身不发荧光且不易显色的试样)。氧化铝也因其是否含粘合剂或荧光剂而分为氧化铝G，氧化铝GF₂₅₄及氧化铝HF₂₅₄等品种。

（2)制备：软板的制备很简单，只要将吸附剂直接平铺在光洁的玻璃或塑料板上即可。但软板的分离效率差，并且很容易松动损坏，所以应用不多。薄层色谱法通常采用硬板。硬板的制备方法是在含粘合剂的吸附剂内加入一定比例的水，调成糊状后铺层。铺层的方法有倾注法，刮层平铺法和涂铺器铺层法，要求制成的板均匀光滑、厚度一致（0.25～1mm)。

（3)活化：把涂好的薄层板放在水平的台面上，在室温下自然凉干，然后放入烘箱加热一定时间，使吸附剂活化（通常，硅胶板在105～110℃活化30 min)。活化后的薄层板放入干燥器备用。

2. 点样  点样前，通常将试样用低沸点的溶剂或与展开剂极性相似的溶剂溶解，配成约1%的试样溶液，应避免用强极性的水或甲醇等溶剂溶解试样，以防样点扩散。点样时，用毛细管或微量注射器吸取试样溶液，然后轻轻与薄层接触，将样液滴加到薄层板上。点样量要适中，点样量过大会造成斑点拖尾，过小则试样组分难以检出。一般将样点点在离薄层板底端约2 cm处的起始线上，样点越小越好，一般直径不超过2～3 mm，点间距离2 cm左右。

3. 展开  样点上的溶剂挥干后，即可进行展开。常用上行展开法，即先将展开剂放在展开缸内，然后将薄层板的点样端朝下，浸入展开剂，但注意不得将样点浸入展开剂中。对于软板，薄层板应近水平方向放置（与水平约成5°～10°角)，对于硬板，薄层板应近垂直方向放置（薄层板与水平成45°～60°角或垂直)，然后迅速盖上缸盖，进行展开（见图8－5)。对于R_f值小的物质，也可用下行展开法，即在薄层板上方放置一溶剂槽，将薄层板的点样端朝上，靠近溶剂槽，另一端朝下，竖放在层析缸中，用滤纸或纱巾把溶剂引到板的点样端，借助重力和毛细作用力使展开剂下移。此法展开剂的移行速度较快，展开距离较大，但是此法比较麻烦，分离效果也不够好，所以实际应用不多。

图8-5 上行展开法示意图

对于成分复杂的混合物，如果一次展开不能完全分离时，可采用二次展开或双向展开。二次展开是在第一次展开后，待溶剂挥干，再用相同溶剂或不同溶剂再展开一次。双向展开所用薄层板为近正方形，将试样点在薄层板的一角，先用一种展开剂沿薄层板的一个方向展开后，取出薄层板，挥干溶剂，再选用另一种溶剂，在与第一次的展开方向相垂直的方向上作第二次展开。双向展开方法分离效果较好，因为这种展开方法将在第一次展开过程中未能分离的试样组分的斑点作为进行第二次展开时的原点，换个方向重新展开，从而使在第一次展开过程中未能分离的试样组分得到分离。

当用混合溶剂作展开剂进行展开时，要防止产生 “边缘效应”（edge effect)的不利影响。所谓“边缘效应”是指同一组分的斑点在薄层中部比在边缘移动慢的现象。即同一组分的R_f值在薄层中部小于边缘两侧。有人认为产生这种现象的原因是由于层析缸内未被混合溶剂的蒸汽饱和，所以薄层板上的混合溶剂（展开剂)不断蒸发，蒸发的速度从薄层中央到两侧边缘逐渐增加，由于极性较弱而沸点较低的溶剂较易挥发，使薄层边缘的展开剂组成与薄层中部不同，边缘处含更多极性较大的溶剂，洗脱能力强，致使靠边缘处的组分迁移速度快。因此，在展开过程中，通常要在层析缸的内壁衬上浸湿了展开剂的滤纸，以加速溶剂蒸发，使层析缸内的混合溶剂蒸汽达到饱和，以消除边缘效应。

4. 显色  展开后的斑点如果有颜色，可直接观察和确定斑点在薄层板上的位置以及颜色深浅，如果没有颜色，则须用显色方法来确定斑点。常用方法有：

（1)紫外光照射法：在紫外光（一般用253.7 nm波长的汞弧灯)照射下，观察薄层板，如果试样能产生荧光，可观察到荧光斑点；如果试样不产生荧光而吸附剂中含荧光物质（如硅胶GF₂₅₄)，则薄层板呈现荧光，斑点为暗色。

（2)气熏显色法：对于有些不饱和有机化合物，可将碘或溴置于密闭容器中，待容器中的碘或溴蒸气饱和后，将展开后的干燥薄层板放入，碘或溴可与化合物可逆地结合，使斑点显淡棕色或黄褐色。显色后可将薄层板取出，立即标记斑点。

（3)喷洒显色剂法：在薄层板上的展开剂挥干后，用喷雾器将显色剂溶液均匀地喷洒在薄层板上，使斑点显现出来。可选用的显色剂种类很多，可根据被测物质，从色谱文献或分析化学手册中查阅选用。

（四)薄层色谱法的定性分析和定量分析

1. 定性分析 薄层色谱法的定性依据是组分的R_f值。薄层经显色确定斑点位置后，计算R_f值，然后根据试样与纯品的R_f值对照定性。由于R_f值受很多因素影响，文献R_f值测定的条件在实际操作中难以完全一致，因此，文献查得的R_f值只能作定性参考。实际工作中，是将试样与纯品在同一薄层板上、以完全相同的操作条件进行分离和测定，根据二者测得的R_f值对照确认。也可采用相对比移值R_st作定性确认。

2.定量分析 薄层色谱的定量方法有：

（1)目视比较法：在同一薄层板上比较试样组分斑点和已知含量的标准品斑点的大小及颜色深浅，估计试样组分的大致含量。此法属半定量方法。

（2)洗脱法：将斑点位置的吸附剂全部刮下，用适当的溶剂将吸附剂中的试样组分洗脱下来，然后再用分光光度法或其它分析方法定量测定。此法要求溶剂对试样组分的洗脱率较高，洗脱完全，其定量准确性比目视比较法高，但操作比较麻烦。

（3)薄层扫描法：薄层扫描法（quantitation by TLC scanning)是应用专用的薄层扫描仪直接在薄层上测量斑点的颜色深浅和大小，从而进行定量的方法。薄层扫描法以一定波长和强度的光束照射薄层上的斑点，并用仪器测量照射前后光束强度的变化。由于光束强度的变化与薄层上斑点的颜色深浅、大小有关，所以薄层扫描法能精确地求得物质的含量。此法测量的灵敏度和准确性都很高。但需要购置价格比较昂贵的仪器。薄层扫描仪的类型和型号较多，目前应用较多、效果较好的是双波长双光束薄层扫描仪。它与双波长分光光度计的原理相同，结构相似。此外，此法对薄层板的质量要求也比较高。

（五)高效薄层色谱法

高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography，HPTLC)是在经典薄层色谱法的基础上发展起来的。HPTLC采用的吸附剂颗粒（平均直径约5 mm)要比TLC采用的吸附剂颗粒（平均直径约20mm)更细、更均匀。HPTLC用聚丙烯酸等高聚物作粘合剂，采用喷雾法制备成均匀、致密、厚度约0.2 mm的高效薄层。这种薄层的展开距离短（约为3～6 cm)，展开时间也相应较少（约3～20 min)。HPTLC的点样、展开、显色以及定量的各个步骤都是采用机械或仪器进行的。采用自动点样器点样，点样量比TLC少，样点也更小；采用程序化多次展开（programmedmultiple development)，可按预定程序作自动多次展开，在各次展开后都用红外线自动烘干薄层，并可按预定程序改变展开剂的溶剂混合比例；展开后采用自动喷雾器显色，并用薄层扫描仪作定量测定。HPTLC比TLC的分离效率高、分离速度快、斑点集中、检出限低（可达ng～pg级)、分离容量大（一次实验最多可将40多种组分完全分离)，其操作条件的选择也较灵活，因此，HPTLC是薄层色谱法的发展方向，是分离复杂物质的有效方法之一。

（六)薄层色谱法的特点和应用

薄层色谱法的主要特点是可以在一块薄层板上同时分离和测定一批试样和标准品，而柱色谱法只可以逐个地单独分离测定各个试样，所以，薄层色谱法的使用效率比柱色谱法高。而且，对于难分离的试样，薄层色谱法可采用双向展开法进行分离，分离效果较好。此外，薄层色谱法还具有样品用量少、分析速度快、所用的设备和方法简单等优点，所以应用范围非常广泛。薄层色谱法在药物检验、法医检验、临床检验以及卫生检验等许多领域被列为一些物质的标准分析方法，例如，在卫生检验领域，薄层色谱法用于食品中营养成分及有害物质黄曲霉毒素、残留农药等的分析测定；在药物检验领域，薄层色谱法用于中国药典中的二百多种药品的分析测定。此外，由于薄层板是一次性使用的，所以可在一些苛刻的、损坏性的分离测定条件下使用，适于作其他色谱方法的预试验。

二、纸色谱法简介

20世纪40年代起，纸色谱法就在生物化学和分析化学领域开始被普遍使用。由于纸色谱法设备简单、操作方便、需要样品量少，所以常用于初步的定性和半定量分析，也可为其它色谱分离摸索方法条件。

（一)方法原理

纸色谱法是以滤纸作载体的平面色谱法。滤纸有较强的吸水性，通常滤纸可含20％～25％的水分，其中6%～7%的水是以氢键作用的方式与纸纤维上的羟基结合在一起的，在一般情况下很难脱去，所以，纸色谱法的固定相通常就是滤纸纤维上吸附的水。在分离一些极性较小的物质时，为了增加这些物质在固定相中的溶解度，也可以使滤纸吸附甲酰胺、丙二醇等极性有机溶剂作为固定相。纸色谱法的流动相（展开剂)是与水等极性溶剂不相混溶的有机溶剂，通过滤纸纤维间的毛细管作用，流动相在滤纸上携带试样组分向前移行，由于不同组分在两相间的分配系数不同，因而产生差速迁移，达到彼此分离。所以纸色谱法的分离原理主要属于正相分配色谱法。由于滤纸纤维也可能对试样组分有吸附或离子交换作用，所以，纸色谱法的分离原理除了上述主要的分配作用外，也可能有其它的一些作用。纸色谱法的分离过程与薄层色谱法基本相似。

（二)纸色谱法的操作步骤

纸色谱法以滤纸作为固定相的载体，除了滤纸的选择，纸色谱法的操作步骤与薄层色谱法相似。纸色谱法的主要操作步骤如下：

1. 滤纸的选择  对滤纸的基本要求是：杂质含量低，无明显荧光斑点，以保证不影响对分离结果的观察；质地均匀，平整无折痕，边缘整齐，以保证展开时展开剂能匀速向前移行；纸纤维松紧适当，以保证展开剂以适宜的速度向前移行；有一定的机械强度，以保证滤纸在被展开剂润湿后仍能维持原状。滤纸有不同的型号，根据其厚度可分为厚型滤纸和薄型滤纸，根据其纸纤维松紧程度可分为快速、中速和慢速滤纸。厚型滤纸载样量大，适宜作定量或制备用；薄型滤纸则适宜作定性用。此外，应根据分离对象和展开剂性质选择不同型号的滤纸。对于R_f值相差较小的混合物，宜选用慢速滤纸；而对于R_f值相差较大的组分，宜选用快速或中速滤纸。当采用正丁醇等粘度较大的展开剂时，宜选用纸纤维疏松的快速滤纸；当采用石油醚、三氯甲烷等粘度较小的展开剂时，宜选用纸纤维紧密的慢速滤纸。

2. 点样、展开与显色  纸色谱法的点样方法基本上与薄层色谱法相同。点样后，将滤纸悬挂在盛有展开剂的层析缸内展开（见图8－6)。纸色谱常用的展开剂有正丁醇、正戊醇、苯甲酸和酚等有机溶剂。展开剂使用前，要预先使展开剂中溶解的水达到饱和，否则在展开过程中会把固定相的水分夺走，影响分配过程的进行。在分离某些易分解的弱酸性或弱碱性试样组分时，可在展开剂中加入适量的弱酸或弱碱（如乙酸，氨水和吡啶等)，以防止这些组分解离。有时为了加大展开剂的极性，使其对极性化合物的展开能力增强，可在展开剂中加入一定比例的甲醇、乙醇。纸色谱法的显色也与薄层色谱法相似，但不能用腐蚀性显色剂，也不能在高温下显色。

图8-6  纸色谱法展开示意图

3. 纸色谱法的定性分析和定量分析 与薄层色谱法相似，纸色谱法定性的依据也是R_f值。纸色谱法的定量通常为半定量方法，一般采用目视比较法或剪纸洗脱法进行定量测定。

  （金念祖)