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实验十七 肝糖原的提取与鉴定 |
【实验目的】 掌握动物组织细胞糖原的提取原理;熟悉肝糖原提取的实验过程;掌握糖原的鉴定方法。 【实验原理】 肝和肌肉组织中糖原的含量最高,因此适于作糖原的提取与鉴定。 用三氯乙酸破坏肝组织的酶且沉淀蛋白而保留糖原。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将滤液中的糖原沉淀,再溶于热水。 糖原溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色,本身无还原性,在酸性溶液中加热可水解为具有还原性的葡萄糖。后者可将碱性铜溶液(班氏试剂,Benedict reagent)中的二价铜氧化成氧化亚铜。利用上述性质,可判定组织中糖原的存在。 【实验试剂和器材】 1.试剂 ⑴ 5%三氯乙酸(acetocaustin)。 ⑵ 95%乙醇。 ⑶ 0.9%NaCl。 ⑷ 碘试剂:I2(iodine)100 mg,KI(potassium iodide)200 mg,溶解于30 mL蒸馏水。 ⑸ 浓HCl。 ⑹ 50%NaOH。 ⑺ 班氏试剂(Benedict reagent):取柠檬酸钠(sodium citrate)173 g及无水Na2CO3(sodium carbonate)100 g放入2000 mL医学.全在线www.med126.com烧杯内,加水约700 mL,加热溶解并以玻棒不断搅和,溶解后待冷却至室温。另用200 mL烧杯,称入CuSO4·5H2O(cupric sulfate)17.3 g,加蒸馏水100 mL,加热溶解。将CuSO4液缓慢倒入前液,不断搅和。补足水量至1000 mL。若试剂混浊,可用脱脂棉过滤入瓶备用。 2.器材 ⑴ 剪刀、漏斗、滤纸、滴管。 ⑵ 天平、酒精灯、水浴锅。 ⑶ 研钵、白瓷板。 ⑷ 电动离心机。 【实验步骤】 1.糖原的提取 ⑴ 迅速处死动物,立即取出肝,称取肝组织1~2 g。 ⑵ 将肝组织放入研钵中,用剪刀尽量剪碎;加入5%三氯乙酸2 mL,将肝组织研磨至糜状;再按5 mL/g肝组织补加5%三氯乙酸。混匀,用滤纸过滤。 ⑶ 取滤液3 mL于塑料离心管中,加入95%乙醇3 mL,加盖后混匀,静置10分钟,以3000rpm离心5分钟,倾去上清液,白色沉淀即为糖原。 2.糖原的鉴定 ⑴ 加蒸馏水2 mL于上述离心管中,用玻棒或吸管将沉淀搅起,转入玻璃试管中。 ⑵ 将试管置沸水浴中加热使沉淀完全溶解,对光观察溶液,可见乳样光泽,记录。 ⑶ 取试管1支,加班氏试剂2 mL,在酒精灯上加热至沸腾;再加入上述糖原溶液5滴,混匀后再在火焰上煮沸1分钟左右,www.med126.com/wsj/冷却后观察颜色并作记录。 ⑷ 取糖原溶液2滴于白瓷比色盘中,加碘试剂1滴,观察并记录其颜色。 ⑸ 在上述剩余的糖原溶液中,加入浓盐酸10滴,置于沸水浴水解20分钟,取出冷却后加50%NaOH 5滴中和。 ⑹ 另取试管1支,加班氏试剂2 mL,于火焰上加热至沸腾;再加入糖原水解液6~8滴,轻摇混匀,在火焰上直接加热1分钟左右,冷却观察并记录结果。 【实验注意事项】 1. 采用颈动脉放血处死兔子,且动作要迅速,以免肝组织淤血。 2. 尽量将肝组织研磨至糜状以释放所有的糖原分子。 3. 糖原水解液加加班氏试剂鉴定时,一定要先加班氏试剂于火焰上加热至沸腾观察有无颜色变化,即检验加班氏试剂是否本身已被还原。 4. 糖原水解液加加班氏试剂鉴定时,尽量在火焰加热久一点,直到观察到颜色变化。 【思考题】 1. 糖原水解液与糖原溶液有何实质区别? 2. 为什么要取肝组织进行提取糖原?其它组织是否都能提取糖原?
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