实验六  凝胶层析分离血红蛋白和维生素B₂

【实验目的】

掌握层析法的基本原理；熟悉凝胶层析技术的基本操作及其应用。

【实验原理】

凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时，由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用维生素B₂（黄色，分子质量为376.36)和血红蛋白（红色，分子质量为64500)混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；维生素B₂相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。这样就可达到分离维生素B₂和血红蛋白的目的。收集洗脱液后，在分光光度计上测定两种组分的吸光度，绘医.学全在线制洗脱曲线。

【实验试剂和器材】

1. 试剂

⑴葡聚糖凝胶SephadexG-25或SephadexG-50。

⑵0.2％维生素B2饱和水溶液 ：称取维生素B₂ 0.2 g，溶于少量蒸馏水，转入100 mL容量瓶,加蒸馏水至刻度。

⑶生理盐水。

⑷血红蛋白溶液：取草酸钾抗凝血2 mL置离心管中，3000r/min离心5min，使血细胞沉淀，弃去血浆及白细胞层。向红细胞沉淀加入生理盐水4 mL，振摇洗涤，3000r/min离心5min，弃去上清液。向沉淀加入蒸馏水2 mL，混匀，猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白。即为上清血红蛋白溶液备用。

⑸0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2)：取0.1 mol/L磷酸氢二钠720 mL和0.1 mol/L磷酸二氢钠280 mL，混匀。

2. 器材

分光光度计、离心机、层析柱、细乳胶管、三角烧瓶 、刻度吸管 、量筒、试管、试管架、滴管、细玻璃棒、可调螺旋夹、坐标纸、铅笔 、玻璃棉或海绵垫。

【实验步骤】

1. 凝胶准备  称取SephadexG-25 5 g或SephadexG-50 3 g，加磷酸盐缓冲液50 mL，置于水中浸泡6小时（沸水浴中溶胀2小时)，用磷酸盐缓冲液漂洗，去除漂浮的细小颗粒。

2. 装柱  取直径0.8~1.2 cm长25~30 cm的层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫。关住层析柱出口，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2 cm高时，打开出口，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达18cm时为止。关闭层析柱出口，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。凝胶床表面要保留1cm高的缓冲液。

3. 样品制备  将维生素B₂饱和水溶液和血红蛋白溶液按1:1(体积比)混匀。

4. 加样  打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。用吸管吸取待分离样品溶液约0.5 mL，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床。然后再用滴管沿层析柱内壁加入磷酸盐缓冲液，约1cm高。加样不可过多，以免分离不完全。

5. 洗脱  将装有细玻璃管的橡胶塞塞住层析柱入口，使细玻璃管的下端插入液面，但不可卫生资格考试网接触凝胶床表面。将装有磷酸盐缓冲液的下口瓶调好位置，使其略高于层析柱，将其流出管接在层析柱橡胶塞的细玻璃管上，保持密闭状态。打开下口瓶出口，然后打开层析柱出口，使磷酸盐缓冲液缓缓流出，保持4~6滴/min的流速。洗脱速度不可过快，以免区带不清晰。

6. 收集  随着层析的进行，凝胶床将出现两条明显的区带，血红蛋白区带在下，维生素B₂区带在上。当血红蛋白区带即将流出时，开始收集，每管收集约1 mL，直到流出液变为无色为止，约需收集5~6管；以同样方法收集维生素B₂。

7. 测定  在540nm波长下，以磷酸盐缓冲液调零，测定血红蛋白和维生素B₂各管吸光度。

8. 结果及分析  以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。分析实验结果并说明原因。

【实验注意事项】

1．在收集过程中，要保持流出液的流速稳定。

2．加样时，保持凝胶上平面不被搅动。

3．液面要始终高于凝胶上平面，否则会导致干柱。

【思考题】

1．小结己知的分离蛋白质的生化方法有哪些?

2．盐析法沉淀蛋白质后，常用透析法脱去蛋白质中盐分，此外，你认为还可用什么方法脱盐。为什么?