实验六 精斑检验
一、精斑预试验
【目的要求】
熟悉掌握紫外线照射法、酸性磷酸酶检测法的原理及方法;了解精斑预试验的其它常用方法。
【实验内容】
(一) 仪器设备及试剂
1. 仪器设备
紫外灯、水浴锅、温箱、烧杯、试管、试管架、毛细吸管、显微镜、载玻片、盖玻片。
2. 试剂
缓冲液、显色剂、碘化钾试剂、0.01%淀粉溶液、碘液。
(二)实验方法
1. 紫外线检查
将可疑精斑检材置于紫外线灯下检查,精斑在紫外线下发银白色荧光,周围较深,带紫蓝色边缘,查见后,将斑痕范围用蜡笔划出。
2. 酸性磷酸酶检出法
(1) 剪取可疑精斑检材少许(约0.1cm2大小)置于试管内,加缓冲液3-4滴。
(2) 将试管放入37℃温箱(或水浴锅)内约5-7分钟。
(3) 加显色剂3-4滴观察结果。
(4) 结果判定:阳性,浅红色至深色或红色沉医学考研网淀;阴性:橙黄色。
3. 碘化钾结晶试验
剪取可疑精斑检材少许置玻片上,加1滴蒸馏水浸软,用针头将基质纤维分离,加盖玻片,从盖玻片边缘滴加试剂1-2滴;镜检。
结果:初见褐色颗粒,逐渐形成褐色或褐红色针状或菱形结晶,有时可检出精子。
二、精斑的精子检出法
【目的要求】
熟悉掌握精子检出法的原理及方法。
【实验内容】
(一)仪器设备及试剂
1. 仪器设备
试管、试管架、剪刀、玻棒、载玻片、盖玻片、显微镜
2. 试剂
生理盐水、酒精(无水、90%、80%、50%)、苏木素染液、盐酸酒精、伊红溶液、二甲苯、中性树胶。
酸性复红亚甲兰染液配制:
1%酸性品红 1ml
1%亚甲兰 1ml
1%盐酸 40ml
酸性品红靛蓝胭脂红染液配制:
第一液:溶解5g硫酸铝于100ml沸蒸馏水中,加0.1g酸性品红,搅拌溶解。
第二液:将0.5g靛蓝胭脂红溶于100ml蒸馏水中,加1ml盐酸,1ml甘油混匀。
(二) 实验方法
剪取斑迹中央部分(精子多集中在斑迹的中央),约1cm2,剪碎置试管内,滴加生理盐水,浸透检材后再多加5-6滴,置室温2h,4℃冰箱12-24h,用玻棒挤压检材,去除粗的纤维,离心20min,上清液供作抗人精液沉淀反应及测定血型用。沉渣则涂于玻片上,用甲醇固定1min,自然干燥后染色镜检,查精子。
1. 苏木素—伊红染色
﹙1﹚ 将涂片浸于95%酒精中2miwww.med126.com/yishi/n;
﹙2﹚ 80%酒精2 min;
﹙3﹚ 50%酒精2 min;
﹙4﹚ 水洗2 min;
﹙5﹚ 苏木素染液5-10 min;
﹙6﹚ 玻片在水中漂洗数次;
﹙7﹚ 1%盐酸酒精分化数sec;
﹙8﹚ 流水冲洗20-30 min;
﹙9﹚ 伊红染色液1.5 min;
﹙10﹚ 水中漂洗数次;
﹙11﹚ 投入50%酒精中后即取出;
﹙12﹚ 95%酒精,10 sec;
﹙13﹚ 无水酒精5-10 sec;
﹙14﹚ 二甲苯1-2 min;
﹙15﹚ 中性树胶封固;
﹙16﹚ 镜检,精子细胞核染色体,其他部分染红色。
2. 酸性复红亚甲兰染色
涂片干燥后,滴加酸性复红亚甲兰染液染5-10,用自来水反复冲洗,用滤纸吸去水分,镜检。精子头部的后半部﹙即核﹚染成兰色,前半部不着色或浅染,体及尾部染成红色。只要见到一个典型的精子,即能确认为精斑。陈旧精斑,处理过分粗暴,往往只见精子头部。如果见到几个典型的精子头部也可确证精斑。
3. 酸性品红靛蓝胭脂红染色
涂片在酸性品红靛蓝胭脂红染液的第一液中染色30 sec。用1%HCl洗去第一液。再用第二染色15 sec。用95%乙醇冲洗,干后用树胶封闭,镜检。精子头部染深紫红色,颈段呈白色、尾部主段和末段染成紫兰色。