关键词：人类角膜
【摘要】 目的 观察体外培养的人类角膜缘干细胞对同种异体外周血淋巴细胞的作用。方法 通过植片技术分离人角膜上皮细胞以及角膜缘干细胞。在两种细胞单层上，观察同种异体外周血淋巴细胞对丝裂原刀豆蛋白Ａ（ConA)的增殖反应。另外，将两种细胞培养上清直接转移到由ConＡ刺激的淋巴细胞增殖系统，以观察两种细胞释放某些因子的抑制效应。结果 单层角膜缘干细胞对ConＡ刺激的外周血淋巴细胞增殖反应可以施加有效的抑制效应。角膜缘干细胞培养上清对ConＡ刺激的外周血淋巴细胞增殖系统，在72h分离上清显示有明显抑制效应。结论 角膜缘干细胞通过细胞交互作用和（或)释放某些抑制性因子对淋巴细胞的活化和增殖发挥潜在的抑制作用。
【关键词】 角膜上皮细胞;角膜缘干细胞;细胞培养
Studies on the keratolimbal stem cell to the pericirculation lymphocyte activation and proliferation
【Abstract】 Objective To investigate the regulation of host lymphocyte activation by the allograft of limbal stem cells.Methods Limbal stem cells and the corneal epithelial cells were cultured and isolated from human corneas by explant technique.The mediums of each cells were gathered time and were freeze at different time in -20℃ after purification.Lymphocytes of the other body were cultured in mediums stimulated by Con A.Limbal stem cells or the corneal epithelial cells of the human were co-cultured with the lymphocytes from the other bodys blood.Lymphocyte proliferation assay was assessed by MTT colorimetric determination.Results Significant proliferation of the lymphocytes was shown after adding the Con A.The gathered supernatant of the 72h either from the limbal stem cells or the corneal epithelial cells was shown a potent inhibitory effect of the lymphocytes proliferation.The monolayer domestic rabbits limbal stem cells,showed a significant suppressive effect on the allograft lymphocytes proliferation after mixed lymphocyte culture for 48h,but this phenomenon couldnt be seen in the monolayer corneal epithelium in vitro.Conclusion The results show that there would be a lot of possible mechanisms that worked independently or worked in concert to inhibit the lymphocytes proliferation,but mainly by cell-cell interaction and/or some other soluble factors,and limbal stem cells would take a role on raising the eye immunity.
【Key words】 corneal epithelium; limbal stem cell; cell culture
在比较联合角膜缘的穿透性角膜移植与单纯大植片角膜移植的术后植片存活率的比较时发现，前者的排斥反应发生率低［1，2］，其机制尚未见研究报道，是否因为角膜缘干细胞有抑制淋巴细胞生长的功能，亦尚无此方面研究报道，我们前期的实验证实兔角膜缘干细胞可通过细胞交互作用和（或)释放某些抑制性因子抑制同种异体兔淋巴细胞的活化和增殖［3］。本实验旨在观察人类同种异体角膜缘干细胞对宿主淋巴细胞活化和增殖的调节效应，并进一步从实验室体外培养角度证实角膜缘干细胞与角膜上皮细胞相比在引起同种异体排斥反应中的作用。
1 材料与方法
1.1 人角膜缘干细胞的培养及条件培养基的制备 在无菌条件下取新鲜人角膜，将角膜分为中央和角膜缘组织，去除角膜内皮细胞以及后2/3角膜板层后，将组织切成1mm×2mm，上皮细胞面向下置于12孔培养板中，每孔有3块组织。加入少量完全细胞培养基（RPMI-1640培养基，10%胎牛血清，1ml双抗)，切勿使组织块漂浮。在37℃体积分数为5%CO2和95%空气条件下进行培养，培养基每1天更换1次，6天去除接种组织块。当细胞形成单层达70%以上时，用0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA液（1∶2)消化传代。在12孔板选择生长良好汇合的传代细胞。在12h内使用无血清RPMI-1640培养基换液3次以去除残留的培养基。然后，每孔加入新鲜无血清培养基2ml，继续培养，每24h收集上清1次，共收集5次。2000ｒ/min离心10min，取上清液，去除细胞碎屑，加入1g/L质量浓度牛血清白蛋白（FBS)。使用3.47μm分子截流量透析袋透析浓缩25倍，-20℃冻存。
1.2 ConA诱导的同种异体人外周血淋巴细胞的增殖 取同种异体人外周血3ml，先用PBS液等量稀释，在缓慢加入3ml的淋巴细胞分离液（上海第一生物制品所研制)。20℃密度梯度离心（2000ｒ/min×20min)后，取出分离好的单核细胞层，用PBS冲洗2次后，加入4ml完全培养基，打匀细胞后，计数。调整细胞浓度至5×109个/L，使用96孔培养板，每孔加细胞100μl，并分别加入各个时间段所取的角膜上皮细胞或角膜缘干细胞的条件培养基50μl，各作6个复孔。设立各组的平行对照组，每孔加入ConA（concanavalin A，C2631,Sigma)至终浓度为2.5mg/L。5ml/L CO2，37℃培养48h。用四甲基偶氮唑盐比色分析法（MTT法)［4］测定所诱导的淋巴细胞转化：各孔加入MTT（5mg/ml)20μl，继续培养4h，低温密度梯度离心（4℃，3000ｒ/min离心10min)，小心吸出全部上清，采用MTT法，每孔加入MTT溶解液100μl，微量振荡器震荡30min，使MTT还原产物甲月替（for mazan)完全溶解。酶标仪测定540nm光密度值（OD)。
1.3 混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR)［5］ 分别将人角膜上皮细胞以及角膜缘干细胞（反应细胞)和同种异体人外周血淋巴细胞（刺激细胞)，等量细胞浓度（0.5×109个/L)混合。使用96孔板，每孔加反应细胞和刺激细胞各100μl。37℃孵育48h，用MTT比色分析法测定所诱导的淋巴细胞转化OD值。
1.4 统计学分析 应用SPSS 10.0医学统计软件，将各组所测的OD值进行单因素方差分析，比较组间差异。P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异有极显著性。
2 结果
2.1 人角膜缘干细胞对丝裂原激活同种异体外周血淋巴细胞的抑制作用 在ConA存在下，人外周血淋巴细胞发生显著的增殖效应。但将ConA加人外周血淋巴细胞在同种异体角膜缘干细胞及角膜上皮细胞培养的不同时间段的条件培养基中共育时，72h收集的不论是角膜缘干细胞或是角膜上皮细胞的条件培养基均对外周血淋巴细胞的增殖有显著性抑制作用（P<0.01)（见图1)。
2.2 与人角膜缘干细胞共育对同种异体外周血淋巴细胞活性的影响 分别将角膜缘干细胞、角膜上皮细胞与等量的同种异体外周血淋巴细胞共育48h，角膜缘干细胞显著减弱同种异体人外周血淋巴细胞增殖反应（P<0.01)（见图2)。
2.3 角膜上皮细胞对外周血淋巴细胞活性的影响 在角膜上皮细胞存在时，同种异体人外周血淋巴细胞活性未见明显受抑制，但角膜上皮细胞培养的72h上清对外周血淋巴细胞有显著抑制效应（见图1、2)。图1 淋巴细胞与角膜上皮细胞及角膜缘图2 角膜缘干细胞以及角膜上皮细胞与淋巴细胞混合培养
2.4 角膜缘干细胞原代培养 与角膜上皮细胞原代培养相比，角膜缘干细胞增殖能力明显强于角膜上皮细胞，培养第3天，可见大量正在分裂的细胞（见图3)，培养第7天角膜缘干细胞增生分化出的上皮细胞已呈片状布满整个培养孔。图3 角膜缘干细胞原代培养
3 讨论
综合所述，可以得到以下推论：（1)角膜上皮细胞分泌的细胞因子有抑制同种异体外周血淋巴细胞的作用，但是将单层角膜上皮与外周血淋巴细胞共育以上作用就显著下降；（2)角膜缘干细胞可分泌抑制同种异体外周血淋巴细胞的细胞因子，并且在形成角膜缘干细胞单层后，这种对同种异体外周血淋巴细胞的抑制作用更强；（3)角膜缘干细胞或角膜上皮细胞体外培养，在72h产生相应的细胞因子对抑制外周血淋巴细胞增殖作用最显著。
以上推论提示：角膜缘干细胞除了具有在角膜移植术后提供角膜上皮生长源泉从而降低排斥发生的作用外，还可能通过下述2条途径来实现其抑制免疫排斥反应的作用：（1)释放可溶性细胞因子；（2)通过细胞膜相关的抑制因子或细胞通讯。已证实在培养状态下角膜缘干细胞可表达IGF-1(insulin-like growth factor type 1)、TGF-β1、TGF-β2、LIF（leukemia inhibitory factor)、bFGF及其相关受体［6］。目前已研究发现在治疗由于干细胞缺乏所致的眼表疾病中，角膜缘干细胞移植术明显提高了单纯行部分穿透角膜移植的手术成功率。这一现象表明了干细胞对维持角膜处于相对免疫赦免状态起着重要作用［7，8］。但是目前尚未见对角膜缘干细胞免疫原性的研究报道，并已证实角膜缘干细胞具有屏障功能，可显著阻碍新生血管的长入［9］，但是角膜缘干细胞是否具有阻碍外周血淋巴细胞进入的功能尚未得到证实。
我们的研究表明，角膜缘干细胞可能通过释放可溶性细胞因子以及细胞间通讯来有效地阻碍同种异体外周血淋巴细胞进入的功能。该作用尚未见其他研究报道证实。角膜缘干细胞移植是否通过阻碍同种异体外周血淋巴细胞进入而提高高危移植的成功率尚需进一步的实验及临床研究。
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