资讯
专业
各省动态
 医学全在线 > 执业药师 > 执业西药师 > 专业知识一 > 药物分析 > 正文
常用定量分析法与应用——酶法,药物分析考试辅导
来源:医学全在线 更新:2007/5/20 字体:

酶法通常包括两种类型:一种是以酶为分析对象的分析,这就是通常所说的“酶活力测定法”;另一种是以酶为分析工具或分析试剂的分析,一般可称为“酶分析法”。前者的目的在于测定样品中某种酶的含量或活性;后者则主要用酶作试剂测定样品中酶以外的其它物质的含量。二者检测的对象虽有所不同,但原理和方法都是以酶能专一而高效地催化某化学反应为基础,通过对酶反应速度的测定或对生成物等浓度的测定而检测相应物质的含量。
  (一)酶活力测定法
  1.基本概念 所谓酶活力,是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。酶反应的速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示,酶反应的速度愈快所表示的酶活力愈高。
  测定酶活力,可用物理法,化学法或酶分析法等方法。常用的方法有:第一,在适当的条件下,把酶和底物混合,测定生成一定量产物所需的时间,此即终点法。第二,将酶和底物混合后隔一定时间,间断地或连续地测定反应的连续变化,如吸收度的增加或减少。第 三,将酶与底物混合后,让其反应一定时间,然后停止反应,定量测定底物减少或产物生成的量。后两种方法称为动力学法或反应速率法:按取样及检测的方式可称为取样测定法或连续测定法。
  酶的活性单位(国际单位IU):是指在25℃下,以最适的底物浓度、最适的缓冲液离子强度以及最适的pH值诸条件下,每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。酶的比活性即定为一毫克酶的活性单位。
  在实际工作中,为了简便,人们往往采用各自习惯沿用的单位,有时甚至可直接用测得的物理量表示,例如,以吸收度的变化值(AA/At)表示酶单位。其它衍生单位:酶溶液的浓度通常以单位数/毫升表示;在估计酶制剂纯度时则用比活力,即以单位重量的酶蛋白中酶的单位数[(单位数/毫克蛋白(或氮)]表示;在酶高度纯净,而且酶的分子量已知,甚至每个酶分子上的活性中心数目也已  知时,还可采用分子活力或转换率表示。它们分别表示在最适条件下每个酶分子或每个活性中心每分钟催化底物分子(或相关基因)转化的数目,这种单位的意义是它可用以进行催化效率的估计和比较。
  2.酶促反应的条件 选择反应条件的基本要求是:所有待测定的酶分子都应该能够正常地发挥它的作用。这就是说,反应系统中除了待测定的酶浓度是影响速度的唯一因素外,其它因素都处于最适于酶发挥催化作用的水平。确定反应条件时应考虑以下因素:
  (1)底物:为了便于测定,选用的底物(包括人工合成底物)最好在物理化学性?上和产物不同。关于测定用的底物浓度,为了不使酶反应速度受它的限制,反应系统应该使用足够高的底物浓度,判别标准是底物浓度[S]与km的关系(km称为米氏常数,是重要的酶反应动力学常数)。例如一般选用底物的浓度[S]= lookm,因为在这种情况下反应速度可达最大速度的99%。大多数酶具有相对的专一性,在可被它作用的各种底物中一般选择Km小的作测定的底物。
  (2)pH:氢离子浓度能对酶反应产生多种影响:它可能改变酶的活性中心的解离状况,升高或降低酶的活性;也可能破坏酶的结构与构象导致酶失效;还可能作用反应系统的其它组成成分影响酶反应,甚至改变可逆反应进行的方向。例如,乳酸脱氢酶反应在pH7时倾向乳酸生成,而pH10时则倾向于丙酮酸形成。因此在进行酶活力测定时要注意选择适宜的反应pH,并将反应维持在这一pH值。
酶反应通常借助缓冲系统来控制pH,因而有一个适宜的缓冲离子和离子强度问题。选择缓冲离子应考虑以下几个问题:①选择的离子的pk值须接近要调整的 pH,因为在这种情况下,缓冲能力最强。②缓冲离子不同,即使是同一酶反应所表现出来的活性水平可能各不相同,甚至最适pH也可能发生变化。③缓冲离子可能与酶活性的必需成分形成络合物而导致酶活性的抑制。例如,磷酸能与多价阳离子如Ca2+等结合,硼酸能与多种有机化合物结合,从而抑制相应的酶活性。④ 缓冲体系常因稀释和温度等变化改变其pH值。
  (3)温度:酶反应对温度十分敏感,因为温度能直接影响化学反应速度本身,也能影响酶的稳定性,还可能影响酶的构象和酶的催化机制。一般而言,温度变化 1℃,酶反应速度可能相差5%左右。因此,实验中温度变动应控制在土0.1℃以内。酶反应的温度通常选用25℃、30℃或37℃。 医学.全在.线www.med126.com
  (4)辅助因子:有些酶需要金属离子,有些酶则需要相应的辅酶物质。为了提高酶在反应系统中的稳定性,有些也需要某些相应的物质。例如,对巯基酶可加入二巯基乙醇、二巯基苏糖醇(DTT)等。
  (5)空白和对照:每个酶反应通常都应该有适当的空白和对照。空白是指杂质反应和自发反应引起的变化量,它提供的是未知因素的影响。空白值可通过不加酶,或不加底物,或二者都加(但酶需预先经过失效处理)。对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果,主要作为比较或标定的标准。
  3.酶活力的测定方法确定了适宜的反应条件后,为了获得正确的结果还需要有适当的测定方法。测定方法有取样测定和连续测定法。取样测定法是在酶反应开始后不同的时间,从反应系统中取出一定量的反应液,并用适当的方法停止其反应后,再根据产物和底物在化学性质上的差别,选用适当的检测方法进行定量分析,求得单位时间内酶促反应变化量的方法。连续测定法则是基于底物和产物在物理化学性?上的不同,在反应过程中对反应系统进行直接连续检测的方法。,显然从准确性和测定效率看连续法都比较好。现简述下。’、
  (1)取样测定法:在该方法中停止酶反应通常采用添加酶的变性剂的办法,如加5%的三氯醋酸、3%的高氯酸或其它酸、碱、醇类。三氯醋酸是一种高效专一的蛋白质变性剂和沉淀剂,其缺点是在紫外光区有吸收,而高氯酸没有此缺点,并且用氢氧化钠中和、冷却后,KCl04还可沉淀除去,但它不适于对酸和氧化剂敏感的测定对象。用于停止反应的试剂应根据具体反应灵活掌握,例如,以对硝基酚的衍生物作底物的酶反应可用氢氧化钠或氢氧化钾停止反应,因为碱有利于硝基酚发色。另一种停止反应的办法是如热使酶失效。
  在取样测定法中应用何种具体的检测方法要根据具体的酶反应而定。常用的检测方法有可见.紫外分光光度法、荧光分析法等。
  取样测定法比较古老,但目前仍广泛采用,这是因为:①它不需要特殊仪器;②几乎所有酶反应都可根据产物或底物的化学性质找出具体测定方法:③由于色源底物和荧光源底物的发展,可在原来的底物分子上接上相应的有色基团、发色基团或荧光基团。例如,在淀粉等多糖分子上接上染料用于淀粉酶、溶菌酶等测定;在磷酸或核苷酸分子上接上硝基酚用于磷酸酯酶等测定。

[1] [2] [3] [4] 下一页

相关文章
药理学第二十七章影响子宫平滑肌药物(考前
槟榔四消丸含量测定方法
药物分析中药分析:砷盐检查法
定西市2008年度执业药师资格考试报名通知
药物分析中药分析:软膏剂
   触屏版       电脑版       全站搜索       网站导航   
版权所有:医学全在线(m.med126.com)
网校课程
考试题库
全站搜索
返回顶部