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常用定量分析法与应用——酶法,药物分析考试辅导
来源:医学全在线 更新:2007/5/20 字体:


  (二)酶分析法
  酶分析法是一种以酶为分析工具(或试剂)的分析方法。分析的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至酶的抑制剂。在进行这类分析时,先要根据分析对象选择适宜的“工具酶”,然后再通过酶反应的测定,并借助相应的校正曲线来测定它们的浓度或含量。在上述几种检测对象中,除了底物可以采用总变量分析法外,其他都只能用动力学分析法。
  1.动力学分析法这种分析法的原理是:通过条件控制,分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用,这时酶反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系,这样测定酶反应的速度就可求出它们的浓度。酶分析法采用的条件和酶活力测定法的条件基本相同,但其所用的酶量必须一定.被测物以外的其他反应成分均须保证处于恒定和最适。以下分别简述各种物质测定应注意的问题。
  (1)被测物是酶的底物:当底物浓度[S]〈km时,酶反应相对底物而言具有一级反应性态,即酶反应速度与底物浓度成正比,u=k·[S],因此测定酶反应速度可以得知其浓度。
(2)被测物是辅酶:需要NAD(P)、coA之类辅酶的反应可看作是双底物反应,这些辅酶可看作是底物之一。当另一类底物浓度足够高时,反应变为单底物反应;那么反应速度将与其成正比。以CoA的测定为例,它是α-酮戊二酸脱氢酶的辅酶:
此反应可通过340nm吸收度的变化来测定,当另外二种底物处于足够高的浓度时,反应速度与CoA的浓度成正比。
  (3)被测物为活化剂:当其他条件最适且一定时,活化剂在低浓度范围内,酶反应速度随活化剂浓度增大而升高,并在一定范围内具有线性比例关系。但是用动力学方法测定时有两个问题应注意:①活化剂浓度超过一定水平后常导致抑制;②对于某一种酶,相似的离子往往也能表现出活化作用,因此测定不专一,易受到干扰。
  (4)被测物是抑制剂:不可逆抑制剂对酶反应产生的抑制程度随抑制剂浓度呈线性增加,而且酶反应的最终抑制程度由抑制剂的绝对量决定;可逆抑制剂在底物浓度一定时,在低的抑制剂浓度范围内,酶反应速度随抑制剂浓度升高呈线性降低。因此均可以用动力学方法测定,而且测定往往极为灵敏。例如,胆碱酯酶能用于检测10-l0g水平的有机磷化合物。这种测定应注意的是:某些抑制剂能抑制多  种酶;而有些酶能被几种相似的抑制剂所控制,因而如果“工具酶”选择不当,就易受到干扰。
  对酶分析法来说,在建立了适宜的反应和测定系统后,还必须制备一条酶反应速度相对于相应的被测物浓度的标准曲线,以便对未知样品的量进行检测。值得强调的是,在测定未知样品时,所采用的反应、测定系统和制备标准曲线时所用的系统应完全相同,而且待测样品的浓度还应控制在这一曲线范围以内。
  2.总变量分析法又称为平衡法或终点法。这是根据被测物质的性质,选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用,然后在反应完成后,借助物理化学方法测出其总变化量,并参考反应的平衡点,计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。仅适用于底物物质的测定,应用时应考虑工具酶的用量与反应的平衡点。
  终点法要获得好的测定结果,重要条件是:①被测底物的浓度应很小,并控制反应于1级反应水平。因为这样可以使反应速度达到平衡点;防止过多的产物生成,避免逆反应。②其它因素应尽量处于最适水平,双底物反应的另一底物应具有足够高的浓度。③酶的用量要高,以保证反应较快地达到终点。
  酶比较昂贵,因此有一个适宜的用量问题。一般而言,工具酶用量可控制在1~2 km单位(U/m1)左右。而终点法的测定时间多控制在2~10min。
  (三)酶分析法应用示例
  示例一 胰蛋白酶效价测定
  本品系自牛、羊、猪的膜中提取的蛋白水解酶。按干燥品计算,每1mg的效价不得少于2500单位。
胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸精氨酸等碱性氨基酸的羧基组成的肽键,酰胺键及酯键,其水解速率为酶键〉酰胺键>肽键。也可水解间位经基苯甲酸酶及脂肪酸酶,以及变性蛋白如酶蛋白、血红蛋白。因此可选用蛋白或含有碱性氨基酸的酰胺、酶等作为底物测定其酶活力。因酶蛋白可被很多蛋白水解酶水解,缺乏专一性,故目前均采用专属性较离的N-苯甲酰酰-L精氨酸乙酯(BAEE)作为本品的底物。
  供试品溶液的制备 精密称取本品适量,用0.001mol/L盐酸液溶解并制成每1m1中含50~60胰蛋白酶单位的溶液。
  底物溶液的制备取N-苯甲酰-L精氨酸乙酯盐酸盐85.7mg,加水溶解使成100ml,作为底物原液;精密量取10ml,用磷酸盐缓冲液(取0.067mmol/L磷酸二氢钾溶液13ml与0.067mol/L磷酸氢二钠溶液87ml混合,pH7.6)稀释成100ml,恒温于25.0±0.5℃,在253nm波长处,以水做空白,测定吸收度,必要时可用磷酸盐缓冲液(pH7.6)或上述底物原液调节,使吸收度在0.575~0.585之间,作为底物溶液。底物溶液应在制成2h内使用。
  测定法取底物溶液3.0ml与0.001mOl/L盐酸液0.2ml,混匀,作为空白。另取供试品溶液0.2ml与底物溶液(预热至25±0.5℃) 3.0m1,立即计时并摇匀,比色池内的温度应保持在25士0.5℃,在253nm波长处,每隔30s读取吸收度,共5min。以吸收度为纵坐标,时间为横坐标,作图;每30s吸收度的改变应恒定在0.015~0.018之间,呈线性关系的时间不得少于3min。若不符合上述要求,应调整供试品溶液的浓度,重新测定。在上述吸收度对时间的关系图中,取呈直线部分上的吸收度,按下式计算:
(公式)
  式中P:为每1mg胰蛋白酶供试品中含胰蛋白酶的单位数;A1为直线上终止的吸收度;A2为直线上开始的吸收度;T为A1至A2读数的时间(min);W为测定液中含供试品的mg数;0.003为在上述条件下,吸收度每分钟改变0.003,即相当于1个胰蛋白酶单位。
影响效价测定的因素
  (1)酶浓度:在固定底物浓度、反应温度、pH等条件下,调整反应液的酶浓度是效价测定的关键,酶浓度过高或过低都不能使反应速率保持恒定,最佳的测定浓度为50~60IU/ml。
  (2)温度:温度变化对酶促反应速率较敏感,温度每升高1℃,活力单位约增高5%,反之,则下降。为准确控制反应温度,除调节水浴  温度或室温外,由于在测定时受仪器散热和光照等影响,故必须随时测量比色池内反应物的温度,以保证测定结果的准确性。
  (3)底物:因BAEE酶键易水解,其水溶液不稳定,故该底物溶液应在配制后3h内使用BAEE底物测定本品酶活力,操作简便,准确度高,RSD一般可控制在5%以下。
示例二 胃蛋白酶的活力测定[3]
  本品系自猪、羊或牛的胃粘膜中提取的胃蛋白酶,具有催化蛋白质水解的能力。在实验条件下,胃蛋白酶催化血红蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸。利用水解产物中芳香氨基酸如苯丙氨酸、酶氨酸和色氨酸有紫外吸收,用紫外分光光度法直接测定,并计算出本品的酶活力。每1g检品中含蛋白酶活力不得少于 3800单位。
对照品溶液的制备 精密称取经105℃干燥至恒重的酪氨酸适量,加盐酸溶液(取1mol/L盐酸溶液65时,加水至1000ml)制成每1ml中含0.5mg的溶液。 医学.全在线www.med126.com
  供试品溶液的制备 取本品适量,精密称定,用上述盐酸溶液制成每1ml中约含0.2~0.4单位的溶液。
  测定法取试管6支,其中3支各精密加入对照品溶液1时,另3支各精密加入供试品溶液1ml,置37土0.5℃水浴中,保温5min,精密加入预热至37± 0.5℃的血红蛋白试液5ml,摇匀,并精确计时,在37土0.5℃水浴中反应10min。立即精密加入5%三氯醋酸溶液5ml,摇匀,滤过,取续滤液备用。另取试管2支,各精密加入血红蛋白试液5ml,置37±0.5℃水浴中保温10min,再精密加入5%三氯醋酸溶液5ml,其中1支加供试品溶液 1ml,另1支加上述盐酸溶液1ml,摇匀,滤过,取续滤液,分别作为供试品和对照品的空白对照,照分光光度法,在275nm的波长处测定吸收度,算出平均值As和A,按下式计算:
(公式)
  式中:Ws为1ml对照品溶液中含酶氨酸的量(μg); W为供试品取样量(g); n为供试品的稀释倍数;A,As分别为对照品溶液及供试品溶液吸收度的平均值;181.19为酪氨酸的分子量。
  在上述条件下,每分钟能催化水解血红蛋白生成1μmol酶氨酸的酶量,为一个蛋白酶活力单位。
  本法是通过酶促反应动力学和正交试验研究,确定酶和作用物的浓度、反应时间、温度和pH等最佳反应条件而建立的,具有灵敏度高、操作简便等优点。测定时,滤液须澄清,否则将影响结果的准确度及精密度。
影响效价测定的因素

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