第四节 鉴别与结构测定
一、色谱法在黄酮类化合物鉴别中的应用
1.纸色谱(PC)
适用于分离各种天然黄酮类化合物及其苷类的混合物。混合物的鉴定常采用双向色谱法。以黄酮苷类为例来说，一般第一向展开采用某种醇性溶剂，如n-BuOH-HAc-H2O(4：1：5上层，BAW)，主要是根据分配作用原理进行分离。第二向展开溶剂则用水或水溶液，如2%～6%HAc。主要是根据吸附作用原理进行分离。
黄酮类化合物的苷元中，平面性较强的分子如黄酮、黄酮醇、查耳酮等，用含水类溶剂如3%～5%HAc展开时，几乎停留在原点不动(Rf<0.02);而非平面性分子如二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢查耳酮等，因亲水性较强，故Rf值较大(0.10～0.30)。
黄酮类化合物分子中羟基苷化后，极性即随之增大，故在醇性展开剂中Rf值相应降低，同一类型苷元，Rf值依次为：苷元>单糖苷>双糖苷。但在用水或2%～8%HOAc，3%NaCl水溶液或1%HCl展开时，则上列顺序将会颠倒，苷元几乎停留在原点不动，苷类的Rf值可在0.5以上，糖链越长，则Rf值越大。
2.硅胶薄层色谱
用于分离与鉴定弱极性的黄酮类化合物较好。分离黄酮苷元常用的展开剂是甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5：4：1)，并可以根据待分离成分极性的大小适当地调整甲苯与甲酸的比例。
3.聚酰胺薄层色谱
适用范围较广，特别适合于分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类。由于聚酰胺对黄酮类化合物吸附能力较强，因而需要用可以破坏其氢键缔合的溶剂作为展开剂。在大多数展开剂中含有醇、酸或水。
二、紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴别中的应用
1.测定样品在甲醇溶液中的UV光谱。
2.测定样品在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后得到的UV及可见光谱。常用的诊断试剂有甲醇钠(NaOMe)、乙酸钠(NaOAc)、乙酸钠-硼酸(NaOAc-H3B03)、三氯化铝(AlCl3)及三氯化铝-盐酸(AlCl3-HCl)等。
3.如样品为苷类，则可先进行水解，或甲基化后再水解，并测定苷元或其衍生物的UV光谱。各种诊断试剂的详细配制方法及测定程序可参看有关文献。
(一)黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱特征
黄酮、黄酮醇等多数黄酮类化合物，因分子中存在如下所示的桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系，故其甲醇溶液在200～400nm的区域内存在两个主要的紫外吸收带，称为峰带Ⅰ(300～400nm)及峰带Ⅱ(220～280nm)。
1.黄酮及黄酮醇类
两者UV光谱谱形相似，但带Ⅰ位置不同，可据此进行分类：黄酮带Ⅰ<350nm，黄酮醇带Ⅰ>350nm。
2.查耳酮及橙酮类
共同特征是带Ⅰ很强，为主峰;而带Ⅱ则较弱，为次强峰。
3.异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇
这三类化合物中，除有由A环苯甲酰系统引起的带Ⅱ吸收(主峰)外，因B环不与吡喃酮环上的羰基共轭(或共轭很弱)，故带Ⅰ很弱，常在主峰的长波方向处有一肩峰。
根据主峰的位置，可以区别异黄酮与二氢黄酮及二氢黄酮醇类。前者在245～270nm，后两者在270～295nm。
(二)加入诊断试剂后引起的位移及其在结构测定中的意义
三、氢核磁共振在黄酮类化合物结构分析中的应用
(一)A环质子
1.5,7-二羟基黄酮类化合物
其中，H-6及H-8将分别作为二重峰(J=2.5Hz)，出现在δ5.70～6.90区域内，且H-6信号总是比H-8信号位于较高的磁场区。当7-OH成苷时，则H-6及H-8信号均向低磁场方向位移。
2.7-羟基黄酮类化合物
A环上有H-5、H-6、H-8三个芳香质子。
H-5因有C-4位羰基强烈的负屏蔽效应的影响，以及H-6的邻偶作用，将作为一个二重峰(J=Ca. 9.0Hz)出现在δ8.0左右，位于比其他芳香质子较低的磁场。H-6因有H-5邻偶(J=Ca. 9.0Hz)及H-8间偶(J=2.5Hz)的作用，将表现为一个双二重峰。H-8因有H-6的间位偶合作用，故显现为一个裂距较小的二重峰(J=2.5Hz)。
(二)B环质子
1.4′-氧取化黄酮类化合物
B环质子分为H-3′，H-5′和H-2′，H-6′两组，各以相当于2个氢的双峰信号((J=8.5Hz)出现在δ6.5～7.9区域。H-3′，H-5′的化学位移总是比H-2′，H-6′的化学位移值小。
2.3′，4′-二氧取代黄酮类化合物
H-5′为d峰(J=8.5Hz)，出现在δ6.70～7.10处。H-2′(d，J=2.5Hz)和H-6′(dd，J=8.5、2.5Hz)，出现在δ7.20～7.90范围。
3.3′，4′，5′-三氧取代黄酮类化合物
H-2′及H-6′将作为相当于两上质子的一个单峰，出现在δ6.50～7.50范围内。
(三)C环质子
1.黄酮醇类
因为C环上没有质子，因此没有特征峰。
2.黄酮类医学全.在.线.提供. www.med126.com
该类化合物的H-3常常作为一个尖锐的单峰信号出现在δ6.30左右。
3.异黄酮类
异黄酮上的H-2，因正好位于羰基的β位，且通过碳与氧相接，故将作为一个单峰出现在比一般芳香质子较低的磁场区(δ7.60～7.80)。
4.二氢黄酮及二氢黄酮醇
(1)二氢黄酮
H-2与两个磁不等同的H-3偶合，故作为一个双二重峰出现，中心位于δ5.20处。两个H-3，因有相互偕偶及H-2的邻偶，将分别作为一个双二重峰出现，中心位于δ2.80处，但两组峰常有相互重叠现象。
(2)二氢黄酮醇
在天然存在的二氢黄酮醇中，H-2及H-3多为反式双直立键，故分别作为一个二重峰出现(J=Ca.11.0Hz)。H-2位于δ4.90前后，H-3则位于δ4.30左右，两者很容易区分，据此还可确定C-2及C-3的相对构型，即两质子互为反式。
(四)糖上的质子
(五)C6-CH3及C8-CH3质子
(六)乙酰氧基的质子
(七)甲氧基上的质子
除若干例外，甲氧基质子信号一般在δ3.50～4.10处出现。
