第三部分 其他微生物学
实验二十 衣原体、立克次体、支原体
一、衣原体
衣原体(chlamydia)是一类营严格细胞内寄生，有独特发育周期的原核细胞型微生物。其培养方法类似病毒，有鸡胚接种、组织培养和动物感染。沙眼衣原体的培养方法主要为前两种。从沙眼患者眼结膜刮取的标本或经培养的材料，均可观察到在宿主细胞浆中的包涵体。本实验采用鸡胚培养法。
沙眼衣原体的培养和包涵体的观察
【材料与方法】
1．从沙眼患者眼结膜上穹窿病变部位刮取标本，将其放入2～3ml肉汤或Hanks液(含有2500ug/ml的链霉素)中。
2．将标本接种5～8d龄鸡胚卵黄囊，每个鸡胚接种0.2ml。每份标本接种3～5个鸡胚，置35℃孵育。
3．直至鸡胚表现出血、垂死或死亡时，取出卵黄囊，用生理盐水漂洗后，剪碎囊膜制成混悬液。
4．用悬液制成推片，待干后作姬姆萨染色，镜检观察包涵体。
【结果】
染色片可见细胞外有大量原体，鸡胚卵黄囊细胞浅蓝色的胞浆内可见染成深蓝色的包涵体，有4种典型形态。
散在型：呈圆形或卵圆形，散布于胞浆中，1个上皮细胞内可有1～3个或更多。
帽型：紧贴于细胞核上，呈帽状。
桑椹型：呈长梭形/椭圆形，由原体或始体集成桑椹状。
填塞型：主要由原体构成，充满细胞浆，将细胞核挤压变形。
二、立克次体医.学全在线
立克次体(rickettsia)是一类专性细胞内寄生的微生物。在自然界，天然寄生于蚤、蜱、螨等节肢动物体内，并以此类节肢动物为媒介，传染给动物或人而引起各种疾病，如斑疹伤寒、恙虫病等。
立克次体多为球杆状，结构似细菌，有细胞壁和细胞膜；专性细胞内寄生，用马氏(Macchiavello)染色为红色，姬姆萨(Gimenza)染色呈www.med126.com紫色。油镜观察立克次体在细胞分布位置不同，可作鉴别用。如普氏立克次体常散在于胞浆中，恙虫病立克次体在胞浆内靠近核旁成堆排列，而斑点热立克次体在胞浆或胞核内均可找到。
恙虫病立克次体形态与培养特性
【材料与方法】
1．恙虫病立克次体鸡胚卵黄囊接种培养后卵黄囊膜涂片。
2．姬姆萨染色镜检。
【结果】
姬姆萨染色呈紫色多形态，但大多为球杆状，胞浆内靠近核旁成堆排列。
三、支原体
支原体(mycoplasma)是一类能用人工培养基培养的最小微生物，由于缺乏细胞壁，因而其形态呈高度多形性。在营养高的人工固体培养基上，形成微小集落(图20-1)。支原体感染人体后，在血清中产生抗体，可通过冷凝集试验检测。
图20-1 人型支原体在固体培养基上典型油煎蛋状菌落，
解脲脲原体在固体培养基上呈微小菌落(箭头指向)
【材料与方法】
1．支原体的人工培养(以口腔内支原体为例)
(1)用棉拭子在Hotfick培养基平板上密集划线，接种2个平板。
(2)将一个平板置5%CO2、95%N2环境中，另一平板置普通温箱，37℃培养1～2W。培养过程中应保持一定湿度，以免平板干裂。
(3)一周后每日观察平板上有无小集落生长。
2．支原体的集落和形态观察
(1)低倍镜下选择1个集落，连同琼脂切下置载玻片上，集落面向载玻片。将载玻片放入80～85℃热水中，见琼脂发白脱落即取出。自然干燥后，作姬姆萨染色，观察集落。
(2)取支原体集落涂片，作姬姆萨染色，观察形态。
【结果】
(1)初次分离时，约1W在平板上可见微小集落。染色后低倍镜下可见集落呈“油煎蛋”状，即圆形，边缘整齐，较透明，色浅淡。集落中心着蓝紫色。
(2)涂片在镜下见支原体呈高度多形性，常有球形、杆状、丝状、环状、分支状和颗粒状，染成蓝紫色。
