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医学微生物学-实验指导:实验十九 乙型肝炎病毒的微生物学检查
来源:南华大学资源网 更新:2013/9/10 字体:

实验十九  乙型肝炎病毒的微生物学检查

侵犯人体肝脏并致病的肝炎病毒主要有5种,即甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV,或称δ因子)和戊型肝炎病毒(HEV)。HBV属于一类独特的嗜肝病毒(hepadnaviruses),引起人类乙型肝炎。

通过电镜可直接查找血清中的HBV,通过核酸分子杂交可检查HBVDNA。而检测HBV抗原抗www.med126.com/wsj/体的血清学试验已普遍开展,本实验着重介绍HBsAg等的检测,其他抗原抗体的检测方法与此类似,从略。

一、HBV的免疫电镜检查

通过简易快速的免疫电镜技术(simpleand rapid immune electron microscopy),SRIM)检测HBV。

材料与方法

1.Ag-Ab复合物的制备  将0.1~0.5ml纯化的HBsAg与0.01~0.05ml适当稀释的抗体(视其抗体效价定,一般用1/10)混匀,置37℃水浴30min。

2.浓缩复合物 在2~3层滤纸上放1块厚0.15cm,2.5cm2的1%琼脂糖盐水凝胶块,加1滴Ag-Ab复合物在凝胶上呈水珠状,然后将带有载膜(喷有炭)的电镜铜网倒扣漂浮于液滴上。

3、磷钨酸(PTA)负染 在液滴吸干前用镊子小心取下铜网,面向上置于载玻片上,立即加1滴2%PTA溶液(pH6.5~7.0),染色1~2min。用滤纸小心吸干多余染液后,立即用电镜观察。

4、电镜观察  在5000~10000倍下,寻找有复合物的部位。然后转高倍观察并照相。

【结果】

可在成堆的复合物中观察到免疫“桥”和HBV颗医学三基粒,可见球形或管形等特有的形态和结构。

二、HBsAg的检测

酶联免疫吸附试验是目前检测HBsAg最常用的方法。

【原理】

采用双抗体夹心法。将特异性抗-HBs吸附于固相载体表面,与加入待检血清中的相应HBsAg结合为Ag-Ab复合物,加入过氧化物酶标记的抗-HBs酶结合物,有酶相应底物存在情况下,产生颜色变化,用肉眼判读或酶标仪测定结果。

【材料】

1.包被液 0.02MpH9.6的碳酸盐缓冲液。

2.洗涤液  0.02M pH7.4的PBS-Tween 20(0.05%)液。

3.酶结合物  用辣根过氧化物酶标记的抗-HBs。

4.酶抗体稀释液  0.01M pH7.4的PBS-Tween20液。

5.酶底物液  邻苯二胺(OPD)10mg溶于pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液25ml中,临用前加入30%H2O2 0.12ml。新鲜配制,避光。

6.终止液 2MH2SO4

7.待检血清、阳性血清、阴性血清。

8.聚苯乙烯微量板、微量移液器、吸头等。

方法

1.包被  用包被液稀释抗-HBs为50μg/ml,加入微量板100μl/孔。置4℃过夜后,用洗涤液洗3次,每次3~5min。

2.加样  加入稀释为1/50的待检血清100μl/孔,每个标本作2孔,同时作阳性、阴性和空白对照,置37℃2h洗涤3次。

3.加酶结合物  加入经适当稀释的酶结合物100μ1/孔,置37℃2h洗涤3次。

4.加底物  100μl/孔,避光置37℃20~30min。

5.终止反应  1滴/孔终止液。

结果

肉眼判读时,待测孔颜色与阴性对照一样或更浅,判为阴性。若明显加深,呈黄棕色,判为阳性。用酶标仪检测时,可选择单波长450nm(以空白孔校零)或双波长450/630nm,读取各孔OD值。P/N值≥2.1为阳性,<2.1为阴性。P为被检标本OD值,N为阴性对照OD值。阴性对照OD值低于0.05作0.05计算,高于0.05按实际OD值计算。

注意事项

1.包被后的板,可用0.5~l.0%牛血白蛋白封板,能更好避免非特异反应出现。

2.微量板包被洗涤液吸干后,4℃干燥保存,可在3个月内使用。

3.加入待检血清与酶结合物后,置43℃1h或4℃18~22h与37℃2h效果一样。

4.若用pH9.0的Tris-Tween洗涤液,效果优于pH7.4的PBS洗涤液。

5.配制底物液宜用棕色瓶,微量板加入底物后注意避光。

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