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医学微生物学-实验指导:实验八 动物实验技术
来源:南华大学资源网 更新:2013/9/10 字体:

实验八  动物实验技术

实验动物常用作病原微生物的分离和鉴定,进行动物接种实验应选择易感性高、健康的动物。常用的动物有小鼠、豚鼠和家。根据实验要求可通过皮下、皮内、肌肉、腹腔、静脉等途径注射。感染动物死亡后,必要时进行尸体解剖并作病原体的检查。

一、实验动物接种法

(一)小白鼠接种法

材料

1.小白鼠。

2.无菌注射器(1ml)及针头。

3.碘酒、75%酒精、接种物。

方法

1.皮下注射法:一般注射于腹部。

(1) 用注射器吸取接种物。

(2) 小白鼠固定法:用右手拇指和食指捏住小鼠尾部,使它在桌上向前爬行,轻轻向后拉鼠尾(图8-1),再用左手食指及拇指捉住其两耳及颈部皮肤,将手反转,使小白鼠腹部向上,把小白鼠尾巴和左腿夹于左手小指和手掌之间(图8-2)。

(3) 用碘酒及酒精消毒腹部皮肤,针头稍平刺入皮下,注入接种物0.2~0.3ml,如局部有隆起表示已注入,注射后局部再次消毒(图8-3)。

2.腹腔注射法:常注射于下腹部白线稍左或稍右部位,固定方法同上。注射时先将针头平刺于皮下,然后稍抬起针头刺人腹腔中,注射接种物0.5ml(图8-4)。

3、肌肉注射法:多注射于肌肉发达,无大血管经过的部位,如后腿肌肉,将针头直刺入肌肉深层,注射量不超过0.2ml。

4.脑内注射法:将标本接种幼龄鼠(体重l0g左右)脑内(从眼内眦与鼻根部之间刺入),用左手拇指食指固定头部,注射量不超过0.1ml。

 

  图8-1 小鼠抓持方法图8-2 小鼠徒手固定方法

图8-3 小鼠皮下注射示意图图8-4 小鼠腹腔注射示意图

(二)家兔接种法

材料

1.家兔。

2.无菌注射器和针头。

3.碘酒、75%酒精、接种物。

方法

1.皮内注射法:皮内注射多为观察皮肤反应,所以注射前应将局部毛剪去。常注射在背部。注射局部消毒后,将针头的针孔向上平刺皮层内,注射物推入后,如局部隆起,其上毛孔明显,即表示注入。注射量不超过0.1ml。

2.静脉注射法:多采用外耳缘静脉注射(图8-5)。

(1) 将家兔放入固定盒固定好,拔去注射部位的毛,局部消毒,手指轻弹兔耳使血管扩张。

(2) 针头经皮肤平刺入血管中,回一下血,缓慢注入接种物。

(3) 注射后局部消毒,并用消毒棉球轻压片刻,以免血液流出。

图8-5  兔耳缘静脉注射

二、执业兽医接种后动物管理

实验动物接种后,应仔细管理,以免引起实验室内污染或造成实验中的误差,影响实验结果。

1.隔离:动物经注射感染材料后,应与健康动物分开饲养,并在饲养笼上贴标签,注明接种材料、剂量、日期、途径和接种者姓名,以免混淆。

2.观察:注射后每日观察1~2次,注射动物有无异常。

3.测体重、体温,需要时须每日测体温。一般动物体温较人高,现将常用动物正常体温列于下供参考(肛门测定)。

家兔  38.3~40.8℃

豚鼠  38.6~39.4℃

小白鼠  32.4~38℃

4.动物死亡后,应立即进行尸体解剖。不需解剖者,则焚烧或用消毒液浸包后深埋。

三、细菌致病作用的测定

细菌的致病力包括侵袭力和毒素。前者是指依靠酶的作用或形成荚膜侵袭机体组织的能力,细菌所产生的酶有血浆凝固酶、链激酶、透明质酸酶等。后者有内、外毒素2种。

(一)血浆凝固酶试验(见实验九)

(二)透明质酸酶试验

原理

透明质酸是葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖聚合物,是结缔组织基质成分。乙型溶血性链球菌等产生的透明质酸酶可水解透明质酸,使结缔组织疏松,通透性增高,使细菌和毒性物质易于扩散,故此酶亦称扩散因子。

材料

1.乙型溶血性链球菌肉汤培养滤液(含透明质酸酶)、1%美蓝液(或黑墨汁)、生理盐水。www.med126.com

2.小试管、lml注射器、6号针头等。

3.家兔。

方法

1.将家兔背部两侧毛剪除干净,75%酒精消毒注射部位。

2.将细菌培养滤液与少许1%美蓝液混合,注射0.2ml于家兔一侧皮内,为实验侧。生理盐水与少许美蓝混合,同法注入家兔另一侧皮内,为对照侧。注射时避免液体漏出,以免皮肤着色,影响结果的观察。

3.2h后,比较两侧美蓝在皮下的扩散范围。

结果

家兔试验侧皮下深蓝色扩散区明显大于对照侧,说明了透明质酸酶的作用。

(三)链激酶试验

原理

链激酶,又称溶纤维蛋白酶,能水解血浆纤维蛋白,使凝固的血块溶解,出现液化现象。乙型溶血性链球菌及某些金黄色葡萄球菌株可产生此酶,有助于细菌及毒性产物在感染病灶内扩散。

材料

1.乙型溶血性链球菌肉汤培养物(含链激酶)、四联球菌肉汤培养物、生理盐水、枸橼酸盐抗凝血、5%氯化钙液。

2.小试管、1ml注射器、37℃水浴箱等。

方法

1.取带棉塞小试管3支编号①、②、③,各加入抗凝血1ml。

2.于第①、②、③管内分别加乙型溶血性链球菌培养物、四联球菌培养物、生理盐水各0.5m1。

3.上述3支试管每管加入5%氯化钙0.2ml,摇匀,置37℃水浴10min,待血液凝固,再继续37℃水浴约30min,观察结果。

结果

l.观察时,可将小试管慢慢倾斜至30°,轻轻摇动。凡凝固血块又发生溶解,出现液体者,为链激酶试验阳性,否则为阴性。

2.本试验①管为阳性,②管为阴性,③管为阴性对照,无液体出现。

(四)荚膜的致病作用

材料

1.菌种:Ⅲ型肺炎链球菌。

2.小白鼠。

3.无菌lml注射器和针头。

4.荚膜染色液。

方法

1.取20g左右重的健康小白鼠1只,腹腔或皮下注射肺炎链球菌菌液0.5m1,饲养观察

2.待濒临死亡时,及时解剖,取血接种血平板,作细菌培养。

3.取其腹腔液涂片,作荚膜染色镜检。

结果

1.有毒力的肺炎链球菌,能使小白鼠在12~36h濒临死亡。

2.血培养可获肺炎链球菌纯培养物。

3.有毒力的肺炎链球菌,荚膜染色镜检,可见有明显的荚膜。

四、外毒素的致病作用

材料

1.小白鼠。

2.伤风梭菌培养物(破伤风外毒素)。

3.无菌lml注射器和针头。

方法

将破伤风梭菌接种庖肉培养基,37℃培养48h,吸取上清液,3000r/min离心30min,弃去沉渣。临用时作1∶100稀释。

1.试验组:取小白鼠1只,于一侧后腿肌肉注射破伤风梭菌滤液0.2~1.0ml。

2.对照组:取1只小白鼠,于一侧肌肉注射破伤风抗毒素l00u,30min后,于另一侧肌肉注射0.2~1.0ml破伤风杆菌培养滤液。

结果

逐日观察,实验组小白鼠的后腿及尾巴强直性痉挛,继而延及全身,动物全身痉挛,2d内死亡。此为毒力试验阳性。对照组小白鼠仍健康存活。

五、内毒素的致病作用

材料

1.脑膜炎奈瑟菌内毒素。

2.小白鼠。

3.无菌1ml注射器和针头。

方法

1.取脑膜炎奈瑟菌18~24h培养菌液,60℃加热5~10min,杀死细菌,成为粗制的内毒素。

2.取20g左右重的健康小白鼠1只,将其固定,暴露尾巴,用酒精反复擦拭,使尾部血管充血。

3.取上述处理的菌液1ml,注入小白鼠尾静脉。

4.约5h后,用颈椎脱位法杀死小白鼠,解剖观察。

【结果】

可见皮下弥散性紫瘢,肝脏淤血水肿,肾脏及肾上腺充血,肠系膜及腹壁血管明显充血。

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