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医学微生物学-实验指导:实验十七 病毒的培养
来源:南华大学资源网 更新:2013/9/10 字体:

实验十七  病毒的培养

病毒与细菌不同,它必须依赖宿主细胞才能增殖。采用组织培养分离病毒,常用的方法为鸡胚培养、单层细胞培养法及组织块法。后两者均能在显微镜下直接观察正常细胞的形态,一般分为梭形(成纤维样)及多角形(上皮样)两类。

一、鸡胚培养法

鸡胚培养法为常用的病毒培养方法之一,用于对痘类病毒、粘病毒和疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原、以及研究病毒性质等方面。由于鸡胚培养方法操作简便、受精鸡卵来源丰富,鸡胚本身带病毒的情况少见,特中国卫生人才网别是鸡胚感染粘病毒后,在它的羊水和尿囊液中有大量的游离病毒存在,对动物红细胞可产生血凝现象,因此为初步鉴定病毒提供了一个依据。其接种方法有鸡胚绒毛尿囊膜接种法、羊膜腔接种法及尿囊腔接种法等。在此实验中仅介绍后两种方法。

材料

流感病毒10-3稀释液,9-12d龄鸡胚、无菌1ml注射器及7~9号针头、钢钻、磨牙钻、弯头小镊、灭菌液体石蜡、灭菌毛细吸管等。

方法

1.鸡卵的孵化:选大而壳薄的鸡蛋,用酒精棉球轻拭外壳以除去污物,置于38-39℃的温箱中孵化,箱内必须保持相当的湿度,鸡卵每天翻动1-2次,受精的鸡卵4-5d后即可见到胚胎和血管。

2.鸡胚羊膜腔接种法:(图17-1)

(1) 操作前一天将卵的小端向下直立培养,使胚胎浮在气室下,便于操作。

(2) 接种前检查鸡胚生活情况,并用笔划出气室和胚胎的位置,然后用磨牙钻在靠近胚胎侧磨一方形小窗,每边约1cm。

(3) 用小镊挑去卵壳,撕去卵膜,再滴两滴石蜡油于卵膜上,石蜡油在卵膜上散开使膜透明,这样在照明灯照射下,整个鸡胚明显可见。

(4) 用灭菌1ml注射器抽取少许流感病毒,将针头对准鸡胚直下,穿过绒毛尿囊膜和羊膜进入羊膜腔,为了试针探头针是否确实已到羊膜腔内,可用针头轻击小鸡嘴部,小鸡立即动弹表示针头已进入羊膜腔,推动注射器,注入0.1-0.2ml。

(5) 注射完毕后用胶布封口(胶布先经碘酒处理,并通过火焰烧去余碘),用过的注射器经煮沸消毒,接种的鸡胚置于35-36℃的温箱中孵育48-72h。

(6) 自接种后次日起逐日检查鸡胚生活情况,两日以内死亡者多与病毒接种无关,收获病毒前将鸡胚放入4℃的冰箱中使鸡胚冻死以避免收获时出血。

(7) 自冰箱内取出鸡胚,用碘酒消毒气室端,撕去胶布,并将蛋壳扩大,用小镊撕去卵膜及绒毛尿囊膜,然后用毛细吸管除去囊液,再用左手持镊,镊住羊膜腔,用毛细管插入羊膜腔吸取羊水,一般可吸出羊水1ml左右。

(8) 检查羊水有无凝集鸡红细胞的作用。

图17-1  鸡胚羊www.med126.com/jianyan/膜腔接种法   图17-2  鸡胚尿囊腔接种法

3、鸡胚尿囊腔接种法:(图17-2)

(1) 检查鸡胚生活的情况,用铅笔标明天然气室,然后在绒毛尿囊膜发育区避开大血管处作一直径为1mm的小园圈定为注射入口。

(2) 用碘酒少许消毒注射人口和天然气室的顶端,再用75%的酒精洗去碘。

(3) 用钢钻经过火焰消毒,在注射入口以及气室顶端钻孔。

(4) 用灭菌的1ml注射器抽取病毒液体0.1~0.2ml刺入约0.5cm深后注入。

(5) 注射完毕后,用小镊夹一小块胶布沾95%酒精少许通过火焰燃烧以达到消毒目的后,迅速将火焰熄灭,将注射人口及气室的小孔封贴。

(6) 培养收获同羊膜腔接种法,尿液及羊囊液均可收获。尿囊接种法适于流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒以及新城鸡瘟病毒的传代。但分离培养阳性率不及羊囊接种法。

(7) 取清洁试管2只,标记“1”、“2”。试管内加入收获的尿囊液摇匀,置室温中半小时后观察有无血凝现象并记录结果。

二、原代人胚肾单层细胞制备

原代细胞为直接采自动物或人组织如人胚肾、人羊膜、猴肾等。人胚肾为实验室常用的组织。

材料

1.4~6个月龄新鲜的胎儿(水囊引产或早产死胎)。

2.Hanks液、0.25%胰酶、营养液〔含10%胎牛血清,0.5%水解乳蛋白、三抗(青霉素链霉素、卡那霉素)〕。

3.5.6%碳酸氢钠溶液。

4.无菌培养小瓶、三角烧瓶、吸管、眼科小剪刀及小镊子、橡皮塞。

方法

1.取胚肾:胎儿取俯卧位,用3%碘酒消毒背部及臀皮肤,剪开脊柱两侧皮肤及皮下组织。自肋缘下剪开骶嵴肌,钝性分离拉开切口,用止血钳或镊子夹取肾脏,分离肾周组织,取出肾脏放入无菌平皿中。

2.剪取皮质:将肾包膜剥去,用眼科剪刀从肾表面剪取皮质,除去髓质。将皮质置营养小瓶内,剪成1~3mm3小块,用Hanks液洗数次,直至液体清晰为止。

3.消化:将组织小块移入三角烧瓶内,加0.25%胰酶10ml,同时加入0.1ml三抗溶液,将pH调至8.0左右置4℃冰箱消化18h左右。取出后用Hanks液轻轻洗3次,以除去剩余的胰酶溶液。

4.分散细胞:加入营养液10ml,用刻度吸管吹打,直至组织块细小至不可见,全部成为分散细胞为止。

5.细胞计数:吸0.1ml细胞悬液,加入0.9ml Hanks液,混匀后吸出少量悬液滴入血球计数板,用低倍镜计算,并按下列公式计算每ml细胞数。(4大格细胞数/4×10,000×10=每ml细胞数)。

6.细胞分装及培养:将已计数的细胞悬液,用营养液稀释至每毫升含40万~50万个细胞,将此细胞悬液分装入培养小瓶,每瓶lml,用橡皮塞塞好,充分摇匀置37℃温箱静置培养,以后每日观察细胞生长情况。一般于次日即可见细胞粘于管壁,3~7d长成单层后可使用。

三、HeLa细胞培养法

肿瘤组织经过多次传代可建立传代细胞系,这种细胞能无限传代。HeLa细胞来自子宫颈癌组织,对多种肠道病毒及腺病毒均敏感,故可用于这些病毒的分离。

材料

1.传代HeLa细胞系培养瓶。

3.0.25%胰蛋白酶、三抗、营养液。

4.5.6%碳酸氢钠。

5.无菌培养瓶,吸管等。

方法

1.弃去传代HeLa细胞培养瓶中的营养液。

2.加入5m1 0.25%胰蛋白酶溶液,37℃孵育1~2min。

3.放置细胞瓶使细胞在上,胰酶溶液在下,继续孵育5~10min。

4.除去胰蛋白酶,加入原量的生长液,用10ml吸管吹打分散细胞。

5.用营养液按原量作3倍稀释。然后用1ml吸管分装培养小瓶,使每小瓶含1ml细胞悬液,置37℃培养。

6.单层细胞的生长:培养24h后,HeLa细胞贴于培养瓶壁,表现为单个或2~3个细胞聚集成的小岛,随后细胞开始分裂繁殖,一般3~7d长成单层。HeLa细胞的形态为多形的上皮样细胞。

四、病毒对细胞致病作用的观察

材料

1.HeLa细胞培养小瓶。

2.脊髓灰质炎病毒毒种,腺病毒毒种。

3.细胞维持液(含5%小牛血清,5%水解乳蛋白的Hanks液,其中含有青霉素100u/ml、链霉素与卡那霉素各100μg/ml,pH调至7.4~7.6)。

   4.1ml吸管等。

方法

(一)接种病毒

1.选择生长良好的人胚肾细胞培养小瓶,分试验组(接种病毒)和正常细胞对照组(不接种病毒)。

2.试验组:倾去营养液,每瓶加入维持液0.9ml,然后接种已稀释的脊髓灰质炎病毒液或腺病毒液0.1ml。

3.正常细胞对照组:倾去营养液后,每瓶加维持液lml。

4.置37℃培养,接种24h后,逐日观察结果。

5.接种病毒时注意事项:

(1) 接种病毒时需要两个人配合,严格无菌操作。

(2) 接种病毒时应将吸有毒种的吸管伸入到培养小瓶内,然后轻轻地吹出毒种,切不可将毒种污染环境。

(3) 吸毒种的吸管应及时放入消毒缸内。

(二)病毒感染细胞的指标

1.pH变化

正常细胞代谢时能分解糖类产酸,使维持液中酚红指示剂由红色变黄色。但某些病毒增殖后影响正常细胞代谢,降低了细胞分解代谢产酸的作用,因此维持液pH仍保持原状甚至变碱性。这是反映病毒在细胞中增殖的一个指标。

2.细胞病变

细胞受病毒感染后,由于病毒的增殖,使细胞形态上产生病理改变,不同病毒引起细胞病变的特征有所不同,依次可识别病毒,举例如下:

(1) 脊髓灰质炎病毒:细胞变圆、缩小,细胞之间可有拉丝,折光性强,病变细胞分散较均匀,不成堆聚集,视野较干净。

(2) 腺病毒:细胞肿大变圆,常见的3、7、11型可有折光性很强的粗大颗粒,细胞聚集成葡萄状,细胞层间可见明显撕裂现象。

(3) 疱疹病毒:细胞肿大变圆,边缘较薄,有时有拉丝现象,并可有比一般病变细胞大数倍的大圆形细胞及多核巨细胞。病变细胞的细胞膜、细胞浆、细胞核层次较清楚,可见分成三层的靶形病变细胞。

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