教研室

临床免疫检验

课程

名称

免疫学及检验

学时

4

检验专业2003 级   1、2、3班

带教时间

2006 年11 月2日---  2006 年 11 月 3 日

教师

姓名

王慧

职称

主管技师

实检（见习)项目

单个核细胞的分离及活性鉴定

本次实验

（见习)

目的、

要求

1．掌握单个核细胞分离的有原理及操作方法，熟悉其意义及应用

2．掌握细胞活性测定的原理及方法，熟悉及意义

内容与安排

学时

一、介绍本次实验、见习的重点及安排

（实验课应包括：1、实验标本的采集，2、实验操作步骤，

3、实验操作过程注意事项，4、实验结果的评价及临床意义)

1、原理 根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定比重的液体界面，将外周血中各种不同比重的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。

本次实验采用的是Ficoll分层液法：　　主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll)，分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度住院医师为1.092，单个核细胞在1.076～1.090之间。

2、www.med126.com器材与试剂

3、单个核细胞分离的操作步骤

4、细胞分离的注意事项：1). 注意分离液与稀释血的比例，一般以1:2~1:3为宜。 2). 分离时所取的离心速度与时间，因各台离心机的离心半径而异，需事先通过预试验决定。 3). 加入稀释血时应十分小心，注意保护试管内的界面，勿使混淆影响分离效果。

5、细胞计数及活性鉴定：台盼兰染色法，台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。

6、细胞计数及活性鉴定的注意事项：3分钟内一定要进行检测，时间太长，活细胞也会染上颜色。

7、学生分组试验

二、讨论思考题：

1、如所分离的单个核细胞中混有红细胞，该怎样处理？

2、现分离得到5ML淋巴细胞悬液，计数4大格，计数为600，若要校正细胞浓度为1*10⁵/ML，如何校正？

3、密度梯度离心法分离人体外周血单个核细胞的最适比重是多少？为什么？

三、小结要点

1、实验操作情况

2、需掌握显微镜的使用情况

四、布置学生作业内容

1、1、书写实验报告(包括：实验目的、原理、器材和试剂、操作步骤、注意事项、方法学评价、实验结果、结果分析及结论、讨论)

2、思考题

五、下次实验（见习)课预习范围及后续程介绍

下次实验课内容为：循环免疫复合物测定

预习内容：什么是循环免疫复合物？什么是III型变态反应？

4学时

教案制定时间：  2006  年   月   日   带教老师签名：王慧

专业主任审阅意见；

   签名：  年   月   日