猪瘟诊断及防治
-----
猪瘟俗称"烂肠瘟"是一种具有高度传染性疫病，是威胁养猪业是主要的一种传染病，其特征是：急性，呈败血性变化，实质器官出血，坏死和梗死；慢性呈纤维素性
坏死性肠炎，后期常有副
伤寒及巴氏杆菌病继发。 （1) 流行特点：本病在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和
野猪都易感，一年四季均可发生。病猪是主要传染源，病猪排泄物和分泌物，病死猪和脏器及尸体、急宰病猪的血、肉、内脏、废水、废料污染的饲料，饮水都可散播病毒，猪瘟的传播主要通过接触，经消化道感染。此外，患病和弱毒株感染的母猪也可以经胎盘垂直感染胎儿，产生弱仔猪、死胎、伊胎等。 （2)潜伏期一般为5—7天，根据临床症状可分为最急性、急性、慢性和温和型四种类型。 A：最急性型：病猪常无明显症状，突然死亡，一般出现在初发病地区和流行初期。 B：急性型：病猪精神差，
发热，体温在40—42℃之间，呈现稽留热，喜卧、弓背、寒颤及行走摇晃。食欲减退或废绝，喜欢饮水，有的发生
呕吐。
结膜发炎，流脓性分泌物，将上下眼睑粘住，不能张开，鼻流脓性鼻液。初期
便秘，干硬的粪球表面附有大量白色的肠粘液，后期
腹泻，粪便恶臭，带有粘液或血液，病猪的鼻端、耳后根、腹部及四肢内侧的皮肤及齿龈、唇内、肛门等处粘膜出现针尖状出血点，指压不退色，腹股沟淋巴结肿大。公猪包皮发炎，阴鞘积尿，用手挤压时有恶臭浑浊液体射出。小猪可出现神经症状，表现磨牙、后退、转圈、强直、侧卧及游泳状，甚至
昏迷等。 C：慢性型：多由急性型转变而来，体温时高时低，食欲不振，便秘与腹泻交替出现，逐渐消瘦、贫血，衰弱，被毛粗乱，行走时两后肢摇晃无力，行走不稳。有些病猪的耳尖、尾端和四肢下部成蓝紫色或坏死、脱落，病程可长达一个月以上，最后衰弱死亡，死亡率极高。 D：温和型：又称非典型，主要发生较多的是断奶后的仔猪及架子猪，表现症状轻微，不典型，病情缓和，病理变化不明显，病程较长体温稽留在40℃左右，皮肤无出血小点，但有淤血和坏死，食欲时好时坏，粪便时干时稀，病猪十分瘦弱，致死率较高，也有耐过的，但生长发育严重受阻。 （3) 剖检病变。 急性型：全身皮肤、浆膜、粘膜和内脏器官有不同程度的出血。全身淋巴结肿胀， 多汁、充血、出血、外表呈现紫黑色，切面如大
理石状，肾脏色淡，皮质有针尖至小米状的出血点，脾脏有梗寒，以边缘多见，呈色黑小紫块，喉头粘膜及扁
桃体出血。膀胱粘膜有散在的出血点。胃、肠粘膜呈卡他性炎症。大肠的回
盲瓣处形成纽扣状溃疡。 慢性型：主要表现为坏死性肠炎，全身性出血变化不明显，由于钙磷代谢的扰乱， 断奶病猪可见肋骨末端和软骨组织变界处，因骨化障碍而形成的黄色骨化线。 （4) 实验室诊断：在口述诊断的基础上，可用免疫荧光抗体检查，酶标记组织抗 原定位法，免体交互免疫试验，血清中和试验，猪瘟单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验等方法之一进行确诊。 （5) 防治措施 预防：A、免疫接种。B、开展免疫监测，采用酶联免疫吸附试验或正向间 接血凝试验等方法开展免疫抗体监测。C、及时淘汰隐性感染带毒种猪。D、坚持自繁自养，全进全出的饲养管理制度。E、做好猪场、猪舍的隔离、卫生、消毒和杀虫工作，减少猪瘟病毒的侵入。 （6)疫情处理：A、立即报告，及时诊断。B、划定疫点。C、封锁疫点、疫区。D、处理病猪，做出无害化处理。E、紧急预防接种。疫区里的假定健康猪和受威胁地区的生猪即接种猪瘟免弱毒疫苗。F、消毒，认真消毒被污染的场地、圈舍、用具等，粪便堆积发酵、无害化处理猪瘟(hog cholera，HC或SWliqe fever， sF) 治疗进展 在欧洲称为古典猪瘟{classical swine fever．CSF)，是由猪瘟病毒(HCV或CSFV)引起的一种高度接触性传染病，猪是该病毒唯一的自然宿主。于1 833年首次发现于美国俄亥俄州，百余年来其流行遍及全球。国际兽疫局将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病．是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。中国猪瘟
兔化弱毒疫苗在防治猪瘟中曾起到决定性作用，但近几年来出现免疫效果不理想．应用组织培养弱毒苗也发生免疫失败，究其原因比较多。由于猪瘟造成的经济损失巨大．历来是各国研究的热点。 1 csFV基因结构与功能的研究 CSFV为有囊膜病毒，40--60 nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约1 2 3 kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)．此ORF翻译成含3898个
氨基酸残基．分子量约438 kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白．cSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码。ORF两侧是5’一端非翻译区(5’-UTR)和3’一端非翻译区(3’-UTR)．且5’一端无帽子结构．3’一端无poly(A)尾巴。这一大前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异蛋白酶作用下．加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、c、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、 NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除c、E0、E1和E2为结构蛋白外．其余均为非结构蛋白。 目前已经定位的CSFV蛋白有5种，即 Npro、c、Erns(E0)、E1和E2．它们均由CSFV的 RNA-ORF5’一端所编码。在结构蛋白中，最具有免疫防制研究价值的是EO和E2。 1.1 c,是病毒的衣壳蛋白，也称p14，由病毒ORF中的Setl 69～Al a267组成．是 CSFV核衣壳蛋白其N端由CSFV非结构蛋白p23的水解作用产生，c端可能是由宿主细胞的信号肽酶作用所致。 1．2 gp44／48，是病毒的一种囊膜糖蛋白．也称Erns．旧称E0。有9个可能的糖基化位点，去糖基的蛋白骨架分子量约26KDa，由病毒ORF中Glu168-Ala494组成。在感染细胞中gp44／48在内质网内积累，并可存在于细胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中gp44／48以97KDa的同源二聚体形式存在于囊膜表面。由于其分子内缺乏疏水的膜锚定区，与病毒囊膜结合力弱．易从囊膜上游离下来。gp44／48可诱导产生猪瘟的中和抗体．免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。由于编码 gp44／48的核酸序列在属内比编码gp55的序列保守程度高，因此E rns可作为防治猪瘟的一种靶蛋白。 Erns具有RNase活性，作用于单链的 RNA．且对富含u的序列活性最高。4ng的 Ems在体外即可将CSFV基因组RNA完全降解。推测Ems没有将其自身RNA降解掉的原因可能是由于空间上的隔离。在宿主细胞中，新合成的E rns在内质网腔内．而其基因组RNA则在胞浆中：在病毒粒子中，定位于囊膜的Ems与其基因组RNA间隔着衣壳蛋白．因此E rns是不会降解其自身RNA的。编码Ems的基因是瘟病毒属病毒所特有的．黄病毒科中其他病毒基因组内无此基因．推测该基因是病毒与宿主细胞的RNase基因重组得到的。 1．3 gp33，是CSFV囊膜糖蛋白．也称E1，去糖基的蛋白骨架分子量21．8KDa．由1 95个氨基酸残基(ORF编码的Leu495至GlY68。组成，内有3个可能的糖基化位点。其蛋白骨架中有两段疏水序列(Leu548～ Pro579～Gly689)。在多聚蛋白转位过程中，前一段是E1向内质网腔转位的终止信号，后一段则充当E2转位的信号肽，除此之外，这二段疏水区还充当E1的膜锚定位点。E1在病毒囊膜内．不能诱导猪产生抗体。 1.4 gp55．为CSFV的另一囊膜糖蛋白，又称为E2，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低．最易变异的分子。gp55常以100kDa的同源二聚体及与gp33形成75kDa的异源二聚体形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面。在体外gp55可诱导产生病毒的中和抗体，体内可诱导产生抗CSFV的攻击的抗体。 Hulst用20μg昆曳细胞表达的E2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗1 00LD50 CSFV Brescia毒株强毒的攻击。gp55的蛋白骨架由370个氨基酸(ORF编码的690-1060氨基酸残基)组成．并以其c端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同。E2的分子量可为51-58kDa。E2分子内的1 5个Cys残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，c端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。 g p 5 5的抗原决定区在其N端部分(ORF编码的第690-866氨基酸)，可分为2个独立的抗原结构单元，四个抗原结构域A．B．C，D。其中结构域A又可分为A．， A2，A3三个亚域。结构域B．c属于一个结构单元．均为中和抗体的结合位点．由 ORF编码的690～800氨基酸残基参与构成。Cys693与CYS7377形成的二硫键对结构域 B、c的空间结构至关重要。另一个结构单元含A．D抗原结构域。A1、A2亚区定位于第795-851氨基酸残基，在种内保守A1是一个抗体的中和位点。亚区A3定位于766-813氨基酸残基．而氨基酸残基766-800则参与了结构域D的构成。cys792～ Cys856及Cys818～Cys828间的二硫键对这个结构单元空问结构的形成是必需的。连接这两个结构单元的是一段属内保守的疏水序列．推测这段序列参与了病毒侵入细胞过程中的膜融合过程。 1.5 Npro，也称p23，CSFV的非结构蛋白，是ORF编码的多聚蛋白N端的第一个蛋白质。Npro由168个氨基酸组成．具有蛋白质水解酶活性，能以自催化的方式从正在翻译的多聚蛋白上断裂下来，成为成熟的病毒蛋白。序列比较发现，编码p2 3的基因在瘟病毒属中是较为保守的。它的断裂位点在Cysl 68与其下游的病毒核衣壳p1 4 N端第一个氨基酸ser。间。Npro的 cys69和His130可能位于其酶活性中心．能水解断裂Cys与Ala及Gly与Ser间的肽键，断列位点位于活性His残基下游38个氨基酸残基处。Npro不参与CSFV的结构及非结构蛋白的加工过程．其蛋白酶活性在 c S F V增殖过程中的作用还不清楚。 Rumenapf等人使用定点突变技术对参与 Npro催化活性的氨基酸残基进行测定．确定了其中的GIu22、His49和Cys69是保持Npro蛋白酶活性所必需的氨基酸残基，而 His130并非必须。 2实验窒诊断 目前猪瘟流行常常表现无规律的地区性散发．发病特征不典型，以发热、精神沉郁、食欲减退、
咳嗽、共济失调、结膜炎以及腹泻、围产期死亡、死胎、
流产。中等毒力及强毒感染有以上这些症状，并且在猪群中不分年龄快速传播。结合这些临床症状进行实验室诊断是必要的。 2.1 病毒抗原的检测猪瘟病毒抗原的快速检测对于猪瘟的诊断具有特别重要的意义。目前快速、敏感的检测方法是利用免疫组化技术检测扁桃体组织。扁桃体中猪瘟病毒抗原可早在感染后2d检测到．淋巴结、脾脏以及胰腺均可作为病毒早期检测的组织样品。Delas Mulas等及Narita等报道了一种检测猪瘟病毒抗原的免疫组化方法．即利用针对E2糖蛋白的单克隆抗体检测福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品的免疫组化方法。该方法的优点是能检测长期保存的样品，缺点是较费时．而且福尔马林固定后的组织不能再进行病毒分离。利用链酶一生物素一过氧化物酶(ABc)的免疫组化方法也能用于猪瘟病毒组织切片上抗原的检测。据报道流式细胞仪也可进行血样中猪瘟病毒的检测，但其敏感性较低。以猪瘟强毒感染仔猪，利用抗原捕获ELISA方法检测其病
毒血症，结果表明该方法可用于猪群中
流行病学的调查。但其敏感性以及特异性均低于传统的实验室方法。 2.2 感染性病毒的检测病毒分离是目前体外检测感染性猪瘟病毒最特异的方法。已报道有几种方法可以从组织、全血中分离病毒，白细胞是分离病毒的最佳样品。然而一些研究人员发现，白细胞以及单核细胞在动物感染后较长时间才能感染病毒。因此，对于猪瘟的早期诊断．全血或血浆可能比白细胞更为敏感。最常用于猪瘟病毒分离的细胞为
猪肾细胞(PKl 5或SK6)或猪睾丸细胞(sT)。日本建立了一种猪肾由来的传代细胞系(FS-L3)．FS-L3细胞在不感染病毒的情况下呈大园球状．数倍至数十倍于普通细胞．但一旦感染了猪瘟病毒，FS-L3细胞的大园球状即消失．这一特性已被用作猪瘟病毒的中和试验等各种生物学特性的测定。经研究发现，产生细胞病变的毒株是因为它的遗传基因发生了变化。从5’末端的第一个核苷酸到4764个核苷酸均已缺失．其中包括5’末端的非编码区、自身蛋白分解酶、衣壳蛋白、糖蛋白(E0、 E1、E2)、非结构蛋白NS-1、和NS-2的基因均已缺失。 2.3 猪瘟病毒基因组检测 已报道利用RT-PCR方法检测猪瘟病毒RNA有数种程序。瘟病毒属特异的引物多选自基因组的5’端保守区．其最突出的优点是其产物能用来直接测序，直接进行病毒株的分型。一般来说套式RT-PCR方法是检测猪瘟病毒更敏感的方法，但其缺点是比较费时．不适用于大量样品的检测。 McGoldrick等报道了一种检测猪瘟病毒的单管荧光RT-PCR方法。此方法可检测出仔
猪血样中感染了中等毒力或高等毒力的猪瘟病毒，其敏感性高于病毒分离方法．并且简化了试验程序．减少了污染的风险．还可进行大量样品的检测。 2.4 抗体检测最常用的检测猪瘟病毒抗体的方法多以病毒中和试验为基础。目前已建立数个特异的检测血清抗体的E LlSA方法．包括检测针对粗蛋白、特异结构蛋白如E2、E rns以及非结构蛋白NS3抗体的方法。目前使用最广泛的是CSFV E2 ELISA，其敏感性与VNT相比为90％～99％．特异性为99％。Leforban等建立了一种ELISA方法，能够区分BVDV、BDV以及 CSFV抗体。这个方法对于BVDV／BDV高流行地区(如荷兰)csF的检测非常有意义。ELISA特异性与敏感性的提高是目前面临的最大的挑战。 当前，猪瘟仍是世界养猪业的一大威胁．1 997-1 999年期间在德国、荷兰、西班牙和意大利等国都曾多次暴发了猪瘟，在我国CSFV的持续性感染和疫苗保护效力下降的现象也比较普遍，这不仅给养猪业造成了严重的经济损失，而且也给猪瘟防治政策的制定带来了一定的困难。不过，相信随着CSFV分子生物学和检测方法研究的进一步深入，这些问题都会得到最终解决。
-----
打猪瘟疫苗
