PRRSV、CSFV和JEV混合感染的多联PCR诊断
感谢大夫为我快速解答——该如何治疗和防治
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摘 要：通过对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒等的基因序列分析，设计多联PCR诊断方法诊断发病猪场上述病毒的混合感染，发现单病毒感染率在68.7%～81.5%之间，混合感染率在58.9%～90%之间。采取的防制措施是研制和普遍使用新型疫苗，严防病原体传入，扑杀危险患病猪只，封闭式饲养等综合性措施，获得了较好的效果。关键词：猪繁殖与呼吸综合征；猪“高热病”；多联PCR 近年，在我国不少规模化猪场以繁殖障碍为主要症状的猪病毒性疾病时有发生，尤其是2006年夏季发生的“猪高热病”，有专家称[1-2]其中繁殖障碍性病原起着重要的作用，给养猪业造成严重的经济损失。引起猪繁殖障碍性疾病的病原体比较多，其中猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，猪繁殖与呼吸综合征病病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis B virus，JEV)，伪
狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)，猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)等病原体对规模化猪场的影响最为严重[3]。该类疫病发病后的主要临床症状为妊娠母猪
流产、
早产、死胎、木乃伊胎、畸形胎、产弱仔和长期不发情或屡配不孕，有时以高热为主等。在感染猪群中，PRRSV、CSFV、JEV和PPV等混合感染的现象非常普遍[4-5]，有的是两种病原混合感染，有的甚至是3种以上病原混合感染，给诊断和防治带来了困难。传统的血清学诊断方法，如病毒间接荧光抗体反应，琼脂免疫扩散试验，或病毒的分离鉴定等都存在着繁琐、耗时、特异性差等缺点。如果用单项RT-PCR进行诊断仍然需要多次诊断才能得出结果，因此，需要一种特异、快速、一次可以诊断多种病原的诊断方法。用多联PCR则能比较好的解决这一问题。多联PCR技术是指在同一PCR反应体系中加入多对引物，对多个目的基因同时扩增的方法[5-6]，我们参照文献[5-6]，设计了几对引物，对发生在江苏、河南、山东等一些规模化猪场的可疑病例的病料进行了检测和分析，现报告如下。1 材料与方法1.1 试剂与待检病料dNTPs，Taq酶为Promega公司产品。DNA Marker为DL 2 000，TECH宝生物工程(大连)有限公司产品，PCR仪(PTC-225)为美国MJ公司产品。待检病料由江苏、山东、河南等省几个规模化猪场中发生的繁殖障碍和呼吸障碍病例中采集的可疑病料。参考毒株及试剂由江苏省农科院兽医研究所何孔旺研究员提供。1.2 引物设计根据基因库提供的病毒序列和已发表的PRRSV、CSFV和JEV的序列，参照文献[5-7]，针对CSFV E2基因(囊膜糖蛋白gp55基因)，PRRSV的结构蛋白基因和JEV多聚蛋白的基因序列(表1)设计引物。根据PCR引物设计的原则[8]，参考文献[9-14]，对PRRSV、JEV已知的病毒基因组，利用Hitachi DNAsis软件进行同源性分析，选择同源性高的区域或病毒保守区域作为病毒基因组扩增靶序列。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。在单项PCR引物设计的基础上，利用VNT130软件进行各病毒引物与其他病毒引物的二级结构分析，避免形成稳定二聚体。还要注意3对引物中每条引物与其他引物间不能有5个碱基以上的互补区。 表1 多重PCR引物序列、产物长度以及开放阅读框中位置Table 1 Sequences of PCR primers，product sizes and location within ORFs病毒基因Virus gene引物Primers引物序列(5′～3′)Sequences of primers位置Site in genome产物长度/bplength退火温度/℃Annealing temperatureCSFVCSFV-P1GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG5 077～5 58550861.5CSFV-P2TGATGCTGTCACACAGGTGAA55.6JEVJEV-P1CGGACCAGGCATTCCAAGCGAAG723～1 10638062.1JEV-P2GACGTCCAATGTTGGTTTGTCG58.1PRRSVPRRS-P1ATGCTTTCACGGAGTTCTTGG12 111～12 37326355.9PRRS-P2AGGGTTGACACCTTATGG60.41.3 病料的处理和RNA的提取取采自病猪的肺、脾、肝、淋巴结、扁
桃体等组织脏器于匀浆器内匀浆，加入变性液与之作用。按异硫氰酸胍、酚、氯仿一步法[7,15]进行，即将上述作用液置1.5 mL的离心管内，在混旋仪上混匀2 min，加醋酸钠(pH 4.0)溶液50 μL，混匀，再加入0.6 mL苯酚∶氯仿∶异戊醇(50∶49∶1)混合液，混合后冰浴15 min,4 ℃ 12 000 r/min离心10 min。取水相加等体积异丙醇混匀，置－20 ℃ 1 h，沉淀RNA。在4 ℃以12 000 r/min离心25 min。其沉淀再用0.1 mL变性溶液重新溶解，加入等体积的异丙醇混匀，置－20 ℃沉淀1 h。4 ℃ 12 000 r/min离心25 min，其沉淀即为RNA。用750 mL/L
乙醇晃荡洗涤1次，弃乙醇，置室温吹干，备用。1.4 RT-PCR1.4.1 合成cDNA第一链 取上述总RNA 10 μL， 25 pmol/L P21 μL，混匀后置70 ℃水浴10 min， 然后立即冰浴5 min，再加5ⅹRT缓冲液 (250 mmol/L pH8.3 Tris-HCl,250 mmol/L KCl,50 mmol MgCl2,50 mmol/L DTT， 2.5 mol/L鱼子精)6 μL，dNTPS(各含2.5 mg/ L)1.5 μL，RNasin 1 μL (40 U)， AMV反转录酶1 μL(9 U)，最后加双蒸馏水至30 μL。混匀后置42 ℃作用1 h，然后于94 ℃作用5 min，立即冰浴5 min。1.4.2 PCR PCR总体积为50 μL，取10 μL RT产物置0.5 mL离心管中，依次加入10×PCR buffer 5 μL， dNTPs 4 μL，上下游引物各1 μL(25 pmol/ L)，加双蒸馏水至50 μL， 95 ℃变性5 min，立即冰浴5 min，然后加入Taq DNA聚合酶0.5 μL(2.5 U)，混合后进行PCR循环。扩增CSFV、PRRSV和JEV基因片段的设置参数为：94 ℃ 1 min， 58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35循环，然后72 ℃延伸7 min。PCR结束后，取PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察，分析扩增片段。1.5 扩增片段的测序分析将部分RT-PCR产物用胶回收试剂盒(上海华瞬生物工程公司产品)纯化后直接进行测序，由宝生物工程(大连)有限公司进行。然后用DNA Star软件进行序列同源性分析。2 结果2.1 CSFV检测用RT-PCR方法扩增出了508 bp的核酸条带，与阳性对照的结果相符
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摘 要：通过对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒等的基因序列分析，设计多联PCR诊断方法诊断发病猪场上述病毒的混合感染，发现单病毒感染率在68.7%～81.5%之间，混合感染率在58.9%～90%之间。采取的防制措施是研制和普遍使用新型疫苗，严防病原体传入，扑杀危险患病猪只，封闭式饲养等综合性措施，获得了较好的效果。关键词：猪繁殖与呼吸综合征；猪“高热病”；多联PCR 近年，在我国不少规模化猪场以繁殖障碍为主要症状的猪病毒性疾病时有发生，尤其是2006年夏季发生的“猪高热病”，有专家称[1-2]其中繁殖障碍性病原起着重要的作用，给养猪业造成严重的经济损失。引起猪繁殖障碍性疾病的病原体比较多，其中猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，猪繁殖与呼吸综合征病病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis B virus，JEV)，伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)，猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)等病原体对规模化猪场的影响最为严重[3]。该类疫病发病后的主要临床症状为妊娠母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎、畸形胎、产弱仔和长期不发情或屡配不孕，有时以高热为主等。在感染猪群中，PRRSV、CSFV、JEV和PPV等混合感染的现象非常普遍[4-5]，有的是两种病原混合感染，有的甚至是3种以上病原混合感染，给诊断和防治带来了困难。传统的血清学诊断方法，如病毒间接荧光抗体反应，琼脂免疫扩散试验，或病毒的分离鉴定等都存在着繁琐、耗时、特异性差等缺点。如果用单项RT-PCR进行诊断仍然需要多次诊断才能得出结果，因此，需要一种特异、快速、一次可以诊断多种病原的诊断方法。用多联PCR则能比较好的解决这一问题。多联PCR技术是指在同一PCR反应体系中加入多对引物，对多个目的基因同时扩增的方法[5-6]，我们参照文献[5-6]，设计了几对引物，对发生在江苏、河南、山东等一些规模化猪场的可疑病例的病料进行了检测和分析，现报告如下。1 材料与方法1.1 试剂与待检病料dNTPs，Taq酶为Promega公司产品。DNA Marker为DL 2 000，TECH宝生物工程(大连)有限公司产品，PCR仪(PTC-225)为美国MJ公司产品。待检病料由江苏、山东、河南等省几个规模化猪场中发生的繁殖障碍和呼吸障碍病例中采集的可疑病料。参考毒株及试剂由江苏省农科院兽医研究所何孔旺研究员提供。1.2 引物设计根据基因库提供的病毒序列和已发表的PRRSV、CSFV和JEV的序列，参照文献[5-7]，针对CSFV E2基因(囊膜糖蛋白gp55基因)，PRRSV的结构蛋白基因和JEV多聚蛋白的基因序列(表1)设计引物。根据PCR引物设计的原则[8]，参考文献[9-14]，对PRRSV、JEV已知的病毒基因组，利用Hitachi DNAsis软件进行同源性分析，选择同源性高的区域或病毒保守区域作为病毒基因组扩增靶序列。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。在单项PCR引物设计的基础上，利用VNT130软件进行各病毒引物与其他病毒引物的二级结构分析，避免形成稳定二聚体。还要注意3对引物中每条引物与其他引物间不能有5个碱基以上的互补区。 表1 多重PCR引物序列、产物长度以及开放阅读框中位置Table 1 Sequences of PCR primers，product sizes and location within ORFs病毒基因Virus gene引物Primers引物序列(5′～3′)Sequences of primers位置Site in genome产物长度/bplength退火温度/℃Annealing temperatureCSFVCSFV-P1GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG5 077～5 58550861.5CSFV-P2TGATGCTGTCACACAGGTGAA55.6JEVJEV-P1CGGACCAGGCATTCCAAGCGAAG723～1 10638062.1JEV-P2GACGTCCAATGTTGGTTTGTCG58.1PRRSVPRRS-P1ATGCTTTCACGGAGTTCTTGG12 111～12 37326355.9PRRS-P2AGGGTTGACACCTTATGG60.41.3 病料的处理和RNA的提取取采自病猪的肺、脾、肝、淋巴结、扁桃体等组织脏器于匀浆器内匀浆，加入变性液与之作用。按异硫氰酸胍、酚、氯仿一步法[7,15]进行，即将上述作用液置1.5 mL的离心管内，在混旋仪上混匀2 min，加醋酸钠(pH 4.0)溶液50 μL，混匀，再加入0.6 mL苯酚∶氯仿∶异戊醇(50∶49∶1)混合液，混合后冰浴15 min,4 ℃ 12 000 r/min离心10 min。取水相加等体积异丙醇混匀，置－20 ℃ 1 h，沉淀RNA。在4 ℃以12 000 r/min离心25 min。其沉淀再用0.1 mL变性溶液重新溶解，加入等体积的异丙醇混匀，置－20 ℃沉淀1 h。4 ℃ 12 000 r/min离心25 min，其沉淀即为RNA。用750 mL/L乙醇晃荡洗涤1次，弃乙醇，置室温吹干，备用。1.4 RT-PCR1.4.1 合成cDNA第一链 取上述总RNA 10 μL， 25 pmol/L P21 μL，混匀后置70 ℃水浴10 min， 然后立即冰浴5 min，再加5ⅹRT缓冲液 (250 mmol/L pH8.3 Tris-HCl,250 mmol/L KCl,50 mmol MgCl2,50 mmol/L DTT， 2.5 mol/L鱼子精)6 μL，dNTPS(各含2.5 mg/ L)1.5 μL，RNasin 1 μL (40 U)， AMV反转录酶1 μL(9 U)，最后加双蒸馏水至30 μL。混匀后置42 ℃作用1 h，然后于94 ℃作用5 min，立即冰浴5 min。1.4.2 PCR PCR总体积为50 μL，取10 μL RT产物置0.5 mL离心管中，依次加入10×PCR buffer 5 μL， dNTPs 4 μL，上下游引物各1 μL(25 pmol/ L)，加双蒸馏水至50 μL， 95 ℃变性5 min，立即冰浴5 min，然后加入Taq DNA聚合酶0.5 μL(2.5 U)，混合后进行PCR循环。扩增CSFV、PRRSV和JEV基因片段的设置参数为：94 ℃ 1 min， 58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35循环，然后72 ℃延伸7 min。PCR结束后，取PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察，分析扩增片段。1.5 扩增片段的测序分析将部分RT-PCR产物用胶回收试剂盒(上海华瞬生物工程公司产品)纯化后直接进行测序，由宝生物工程(大连)有限公司进行。然后用DNA Star软件进行序列同源性分析。2 结果2.1 CSFV检测用RT-PCR方法扩增出了508 bp的核酸条带，与阳性对照的结果相符
