2．病原菌的鉴定
通过分离培养得到的病原菌需要进行鉴定，以查明是哪一种细菌。鉴定的方法包括形态学观察、生化特性试验和血清学试验。
(1)形态学观察
不同的病原菌在各种培养基上生长的特点是不同的，菌体的形态和染色反应也不完全一致。这些特点对于细菌的鉴别很有帮助，应仔细观察。
菌落的形态观察：注意菌落的大小、结构是均匀一致还是呈沙粒状，表面是光滑湿润还是干燥无光泽或呈皱纹状，边缘是整齐还是不规则，菌落是隆起、扁平还是呈乳头样，是透明还是半透明或不透明，呈什么颜色等；在半固体培养基上细菌是沿着接种线生长，还是呈均匀浑浊生长，或是呈毛刷样生长，上下是否生长一致等；在特定的选择培养基上是否生长，长出的菌落是否与预期的病原菌相似，在血琼脂培养基上生长是否溶血，溶血环的www.med126.com/shouyi/zhujiage/zhurou/特点如何等。
细菌的形态观察：通过抹片、染色和镜检，观察细菌的形态、大小和排列规律，是否产生芽胞、芽胞的位置如何，能不能运动，有无荚膜，细菌的染色反应如何。细菌的染色对细菌的形态学观察占有非常重要的位置，细菌菌体小而透明，详细观察活体形态很不容易，通过染色，形态特点才清晰可见。此外，各种细菌对不同染料的亲和力不同，可以用鉴别染色的方法识别某些细菌，这对于细菌分类很有帮助。
(2)生化特性试验
细菌分解营养物质时产生各种各样代谢产物。细菌不同，产生的代谢产物也不同，用化学方法检查某些代谢产物的存在，来鉴别和确定某种病原菌。形态特征相近的菌种，仅凭形态学检查是不容易鉴别的，但通过检查它们的代谢产物就可以把它们区别开来。如沙门氏菌和大肠杆菌都是肠道菌，形态、大小、染色特性都相似，镜检不能区别，但它们的生化特性不同，前者不发酵乳糖，后者发酵乳糖，用乳糖发酵方法就可以把这两种细菌区别开来。因此，生化特性试验是鉴别细菌必不可少的方法之一。
●糖发酵试验：有些细菌能分解糖而产生各种酸，有些细菌还继续分解其中的某些酸而产生气体(如二氧化碳和氢)，可根据分解不同的糖类来识别病原菌。试验时将被检菌种接种于糖发酵培养基中，在37℃培养2～3天，如培养基颜色变黄，表示发酵产酸，用“+”表示；培养基变黄，并有气泡，用“○”表示；培养基仍为蓝色，无变化，表示不发酵。培养基有需氧菌培养基和厌氧菌培养基两种。
●需氧菌培养基：用邓亨氏(Dunham)蛋白胨水溶液 (蛋白胨2克，氯化钠0．5克，蒸馏水100毫升，pH7．6)按 0．5％～1％的比例加入葡萄糖或其它各种糖，每100毫升加入1．2毫升的0．2％溴麝香草酚蓝(溴麝香草酚蓝0．2克，0．1摩尔／升氢氧化钠5毫升，加蒸馏水95毫升)，或用1．6％溴甲酚紫酒精溶液0．1毫升作指示剂。分装于试管(每个试管事先都加一枚倒立的小发酵管)，478．8帕(10磅每平方英尺)高压灭菌10分钟。如在培养基中加入琼脂0．5％～0．7％，则成半固体，可省去倒立的小发酵管。但接种时应穿刺。
●厌氧菌培养基：将20克蛋白胨、5克氯化钠、1克硫乙醇酸钠、1克琼脂和1000毫升蒸馏水放于烧杯内，加热混合溶解，再加入10克所需测定的糖，调整到pH7．0，加入指示剂(1．6％溴甲酚紫酒精溶液1毫升)，分装试管，在478．8帕 (10磅每平方英尺)高压灭菌15分钟后，作成高层。将厌氧菌的培养物穿刺接种于此培养基的深部。
●靛基质(吲哚)试验：有些细菌能分解色氨酸而产生靛基质，后者与对二甲基氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。试验时将待检菌接种于邓亨氏蛋白胨水中，在37℃培养 2～3天就可查出，先加入氯仿2毫升，再加科氏(Kovacs)试剂(对二甲基氨基苯甲醛5克，戊醇75毫升，浓硫酸25毫升)2毫升于液面上，如出现红色环，表示阳性反应。有的则需要每天检查，一直观察到6—7天。
也可以用草酸测定。取一滤纸条，在草酸饱和溶液中浸湿，晾干后，悬挂在培养液上面，在37℃培养。若滤纸变红，表示培养物产生吲哚。
●维培(V-P)二氏试验：在有蛋白胨存在的情况下，有些细菌分解葡萄糖而产生乙酰甲基甲醇，在碱性条件下氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色化合物。试验时将被检菌接种于通用培养基中，于37℃培养2天，加入与培养物等量的O"Meara"s试剂(加有0．3％肌酐的40％氢氧化钾水溶液)，猛烈摇振混合。强阳性者约于5分钟后，在培养基表面的下层出现红色反应，长时间无反应，置室温过夜，次日不变者为阴性。此种试验常用来鉴定产气杆菌和大肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。
通用培养基
蛋白胨 5．0克
磷酸氢二钾 5．0克
葡萄糖 5．0克
蒸馏水 1000毫升
将各种成分溶于1000毫升的水中，调至pH7．0，分装试管内，间歇灭菌或478．8帕(10磅每平方英尺)10分钟灭菌。
●甲基红(MR)试验：有些细菌分解葡萄糖，产生酸类物质较多，使培养基变酸(pH4．5以下)。试验所用培养基与V-P氏试验所用的培养基相同。按种被检菌于培养基中培养4天，加入0．02％甲基红酒精溶液数滴，若呈红色，为阳性反应。此种试验也常用来鉴别产气杆菌和大肠杆菌，前者为阴性，后者为阳性。
●柠檬酸盐利用试验：有些细菌把柠檬酸盐做为碳原子的唯一来源。试验时将被检菌接种于柠檬酸钠培养基中，在37℃培养2～4天后利用柠檬酸钠的细菌表现为有细菌生长，使培养基变蓝；不利用的细菌不生长，培养基不变色。此培养基也可用来鉴别产气杆菌和大肠杆菌，前者能生长，培养基变碱，指示剂变蓝，后者不能生长。有些沙门氏菌特别是鼠伤寒沙门氏菌也能生长，但伤寒杆菌和副伤寒杆菌则不能。
Simmons柠檬酸盐培养基
柠檬酸钠 1．0克
硫酸镁 0．2克
氯化钠 5．0克
磷酸二氢铵 1．0克
磷酸氢二钾 1．0克
1％溴麝香草酚蓝酒精溶液 10毫升
琼脂(精制) 20．0克
蒸馏水加至 1000毫升
调pH至6．8，718．2帕(15磅每平方英尺)15分钟高压灭菌后作成斜面。将上述培养基中的琼脂省去，则成液体培养基，同样可以应用，接种、培养、观察同上。
●硝酸盐还原试验：有些细菌能把硝酸盐还原成亚硝酸盐。试验时将被检菌接种于硝酸盐培养基中，在37℃下培养24～48小时，加入下列试剂：
试剂甲
对氨基苯磺酸 0．4克
试剂乙
2－萘胺 0．25克
5摩尔／升冰醋酸 50毫升
每管先加试剂甲0．1毫升，再加试剂乙数滴，如发生红色说明硝酸盐还原为亚硝酸盐。有些细菌还能继续把亚硝酸盐分解成氨和氮，这时加入试剂不会变红。但产生的氮可在培养基中置一倒立的小试管而收集到。
硝酸盐培养基
蛋白胨 5．0克
硝酸钾(化学纯) 0．2克
蒸馏水 1000毫升
将各种成分溶于1000毫升的水中调节pH至7．4，分装试管，每管约5毫升，718．2帕(15磅每平方英尺)高压灭菌15分钟。
●硫化氢试验：有些细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢，其产生的硫化氢会使培养基中的醋酸铅或三氯化铁，形成黑色的硫化铅或硫化铁。试验时将被检菌接种于醋酸铅琼脂斜面上，并沿管壁穿刺至底部。在37℃下培养1～2天后观察，必要时可延长5～7天。若产生硫化氢斜面和底部将变黑；也可将细菌接种在普通琼脂斜面上，在棉塞和试管之间夹入一条事先在醋酸铅饱和溶液中浸泡并晾干的滤纸条，使滤纸悬挂在斜面的上方。培养后若滤纸条发黑，表明产生了硫化氢。
醋酸铅琼脂培养基
高压灭菌的肉汤琼脂 100毫升
高压灭菌的10％的硫代硫酸钠溶液(新配) 2．5毫升
高压灭菌的10％醋酸铅溶液 3毫升
在融化的琼脂内加入硫代硫酸钠溶液，待凉至60℃，再加入醋酸铅溶液，混合均匀，无菌分装灭菌试管达三指高，立即浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。
●明胶液化试验：有些细菌能液化明胶。试验时用接种环将被检菌穿刺接种于营养明胶培养基中直至试管底部，在20～ 25C下培养。在此温度中明胶是凝固的，若发生融化，液化部分呈液体状态，将试管倾斜即可看出。
营养明胶
肉汤培养基 1000毫升
明胶 120～150克
将明胶加入肉汤培养基中，加热溶解后，调节pH至7．4～ 7．6，用棉花纱布过滤，分装试管，718．2帕(约15磅每平方英尺)高压灭菌15分钟，取出直立凝固，不摆斜面。
●尿素酶试验：有些细菌产生尿素酶，能分解尿素。试验时将被检菌接种于尿素培养基斜面上，同时作划线及穿刺，置 37℃培养24小时后观察，培养基从黄色变红色时为阳性。接种量多，反应快的细菌，数小时即可使培养基变红。阴性者应继续观察达4天。
尿素酶培养基
蛋白胨 1．0克
葡萄糖 1．0克
氯化钠 5．0克
尿素 20．0克
磷酸二氢钾 2．0克
0．2％酚红溶液
