二、组织学研究方法
（一)一般光学显微镜术
应用一般光学显微镜（简称光镜)观察组织切片是组织学研究的最基本方法。取动物或人体的新鲜组织块，先用固定剂（fixative)固定（fixation)，使组织中的蛋白质迅速凝固，防止细胞自溶和组织腐败。常用的固定剂如洒精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化锇等，一般常将几种固定剂配制成混合固定液，以抵消或减弱单种固定剂对组织的收缩或膨胀等缺点，达到更好固定效果。固定后的组织块（约3～5mm3大小)用石蜡、火棉胶或树脂等包埋（embedding)成硬块，以切片机（microtome)切成5～10μm厚的组织切片（tissue section)，切片贴在载玻片上经脱蜡等步骤后进行染色。组织块也可立即投入液氮（－196℃)内快速冻结，用恒冷箱切片机（cryostat)制成冷冻切片（frozen section)，这种方法制片迅速，细胞内酶活性保存较好，常用于酶组织化学染色。血细胞和分离培养的细胞可直接涂在玻片上，制成涂片（smear)。疏松结缔组织和肠系膜等软组织可撕成薄片铺在玻片上（铺片)，牙和骨等坚硬组织可磨成薄片（磨片)。组织切片等标本经染色、透明后，以封固剂和盖片封固，即可长期保存，镜下观察。
图1－1 坚牢绿（酸性染料)与亚甲蓝（碱性染料)的化学结构及其染色反应示意
染色（staining)是用染料使组织切片着色，便于镜下观察。天然和人工合成的染料甚多,它们都是含发色团的有机化合物，当染料具有助色团成为盐类物质，即可溶解于水并具电荷，与组织有亲合力，使组织着色。含氨基（－NH2)、二甲氨基〔－N（CH3)2〕等碱性助色团的染料，称碱性染料（basic dye)，它的盐溶液具阳电荷；含羧基（－COOH)、羟基（－OH)或磺基（－SO3H)等酸性助色团的染料，称酸性染料（acid dye)，它的溶液具阴电荷（图1－1)。组织的染色原理一般认为基于化学结合或物理吸附作用。细胞和组织的酸性物质或结构与碱性染料亲合力强者，称嗜碱性（basophilia)；而碱性物质或结构与酸性染料亲合力强者，称嗜酸性（acidophilia)；若与两种染料的亲合力均不强者，称中性(neutrophilia)。组织的基本成分是蛋白质，构成蛋白质的氨基酸常是即有含氨基的，也有含羧基的，是两性电解质。各种蛋白质的等电点因氨基酸成分的不同而异，其电荷性质又与溶液的pH值相关，根据研究目的选用合适的染色方法，调整好染液的pH值，即可取得良好染色效果。常用的酸性染料如伊红、坚牢绿、橙黄G等，碱性染料如苏木精、亚甲蓝、碱性品红等。组织学中最常用的是苏木精（hematoxylin)和伊红（eosin)染色法，简称HE染色法。苏木精使细胞核和胞质内的嗜碱性物质着蓝紫色，伊红使细胞质基质和间质内的胶原纤维等着红色。
物理吸附作用的染色方法，如用苏丹染料显示脂肪组织，染料溶于脂肪内，使细胞内的脂滴显色。又如用硝酸银、氯化金等重金属盐显示细胞和组织的某些结构，则是使金属微粒附着在结构表面而呈棕黑色或棕黄色。银染法中有些组织结构可直接使硝酸银还原而显示，称此为亲银性（argentaffin)；有些结构无直接还原作用，需加入还原剂方能显色，则称为嗜银性（argyrophilia)。还有些组织成分如结缔组织和软骨基质中的糖氨多糖，当用甲苯胺蓝（toluidine blue)等碱性染料染色后呈紫红色，这种现象称为异染性(metachromasia)，其原理可能是该染料在溶液中呈单体状态时显蓝色，当它与多阴离子的高分子物质耦合后，染料分子聚合成多聚体而显红色（图1－2)。还有些染色方法的原理至今还不清楚。
图1－2 异染性示意图
(二)几种特殊显微镜的应用
1．荧光显微镜 荧光显微镜（fluorescence microscope)是用来观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构。荧光显微镜是以高压汞灯产生的短波紫外线为光源，并配有激发、阻断、吸热和吸收紫外线等滤片系统，标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等)在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗)，用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。
2．相差显微镜 相差显微镜（phase contrast microscope)是用于观察组织培养中活细胞形态结构的。活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构。相差显微镜的特点是将活细胞不同厚度及细胞内各种结构对光产生的不同折射作用，转换为光密度差异（明暗差)，使镜下结构反差明显，影像清楚。组织培养研究常用的是倒置相差显微镜（inverted phase contrast microscope)，它的光源和聚光器在载物台的上方，物镜在载物台的下方，便于观察贴附在培养器皿底壁上的活细胞。
3．暗视野显微镜 暗视野显微镜（dark-field microscope)主要用于观察因反差或分辨力不足的微小颗粒。此种显微镜主要是有一个暗视野集光器，使光线不直接进入物境，故呈暗视野。而标本内的小颗粒产生的衍射光或散射光进入物镜，暗视野中的颗粒呈明亮小点，如同在暗室可见一束光线中的微小尘粒一般。普通通光镜最大分辨率为0.2μm，暗视野显微镜则可分辨0.004～0.2μm的微粒，适用于观察细胞内线粒体运动及标本中细菌等微粒的运动等。医学 全在.线提供www.med126.com
4．共集激光扫描显微镜 共焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM)是近10年研制成的高光敏度、高分辨率的新型仪器。它以激光为光源，光束经聚焦后落在样品（组织厚片或细胞)不同深度的微小一点，并作移动扫描，通过电信号彩色显像，经过微机图像分析系统进行二维和三维分析处理。CLSM可对细胞进行三维结构图像分析，细胞内各种荧光标记物的微量分析，细胞内Ca2+、pH值等的动态分析测定，细胞的受体移动、膜电位变化、酶活性和物质转运的测定，并以激光对细胞及其染色体进行切割、分离、筛选和克隆。因此，CLSM是一种高技术产品，可对细胞的多种功能进行全自动、高效、快速的微量定性和定量测定。
其他如偏光显微镜用于研究组织晶体物质及纤维等的光学性质，紫外光显微镜用于研究细胞内核酸的分布与定量等。
