精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。

　　一、盐析法

　　取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。

　　↓4℃，3h以上，使其充分沉淀　　

　　离心（3000rpm),20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

　　↓置4℃3h以上，[此时，（NH4)2SO4的饱和度为33%]

　　重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02% mol/L pH7.4PBS溶解至x ml装入透析袋。

　　↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。

　　取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。

　　影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章 第二节 )。

　　二、冷酒精沉淀法

　　分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水，调节 pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃)到最终浓度为20%，保持在-5℃。产生的沉淀（A)，含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷)中，加有0.05mol/L醋酸调节 pH到5.1，产生的沉淀（B)，包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。调节 上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃)到最终浓度为25%，维持在-5℃。所得到的沉淀（C)含有90%～98% IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀（B)可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B)悬浮在0℃ 水中，调节 pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节 上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在 –2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B)主要含IgA和IgM。医学全在线www.med126.com

表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件

　　三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白

　　原理：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5)，其余均属酸性蛋白。PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG.

　　（一)操作步骤

　　1．DEAE-Sephadex A-50预处理 　称DEAE-Sephadex A-50（下称A-50)5g，悬于500ml蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/L NaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至 pH呈中性；再以0.5mol/L HCl同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/L pH7.4PB中过夜 。

　　2．装柱

　　（1)将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

　　（2)将0.1mol/L ,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。

　　（3)关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

　　3．平衡

　　启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。

　　4．加样及洗脱   启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应<床体积2%，蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内， 至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2～3次 ；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14滴/min。

　　5．收集

　　开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml 。共收集10～15管。

　　6．测蛋白

　　以751型紫外分光光度计分别测定每管OD 280nm, 与OD 260nm,按公式计算各管蛋白含量 。并以OD 280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。

　　7．合并、浓缩

　　将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG（MW6000)浓缩至所需体积，加入0.02% NaN3防腐，于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。

　　8．A-50凝胶的再生

　　在柱上先以2mol/L NaCl洗脱蛋白至流出液的OD 280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次， 再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。

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