（二)注意事项
（1)柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。
（2)纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度 。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。
（3)所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。
（4)洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。
（5)上样的体积要小，浓度不宜过高。
（6)加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化 IgG及IgG亚类
（一)原理
葡萄球菌A蛋白（SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B 柱上的IgG或不同的 IgG 亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
（二)操作步骤
用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。
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装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。
标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。
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加样，一般按25～30mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为<0.02。
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用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0 ；纯化IgG2b用0.1mol/L pH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/L pH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。
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用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。
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收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。
（三)试剂器材
（1)SPA-Sepharose CL-4B （pharmacia)
（2)磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3
（3)枸橼酸缓冲液
0.1mol/LpH6.0
0.1mol/LpH4.0 +0.02% NaN3
0.1mol/LpH3.0
（4)1mol/L pH9.0 Tris溶液
（5)再生缓冲液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。
（四)注意事项
（1)SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法：
先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。
(2)SPA-Sepharose CL-4B亲 合层析法还可用于：①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体（如IgM)的生物学活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。
（3)狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。
